Caracterización genética y estudio de actividades enzimáticas de levaduras vínicas. Mejora de una cepa de saccharomyces cerevisiae con el gen pgu1

• Autores: Mónica Fernández González
• Directores de la Tesis: Ana Isabel Briones Pérez (dir. tes.), Juan Francisco Ubeda Iranzo (codir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de Castilla-La Mancha ( España ) en 2003
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Federico Uruburu Fernández (presid.), Giuseppe Fregapane Quadri (secret.), Rocco Di Stefano (voc.), José Manuel Guillamón Navarro (voc.), Ricardo Cordero Otero (voc.)
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• Resumen

  • En esta Tesis se han abordado los siguientes objetivos:

    1,- Aislamiento de levaduras Saccharomyces no Saccharomyces a partir de mosto y vino e indentificación mediante PCR-RFLP. Los aislados se caracterizaron además por PCR-TTGE existiendo una buena concordancia entre las técnicas moleculares.

    2,- Caracterización directa de la población levaduriforme presente en un tanque de fermentación vínica mediante las técnicas anteriores. Esta aproximación se mostró valiosa por su rapidez y la posibilidad de detectar cepas no Saccharomyces que no se habían puesto de manifiesto por plaqueo.

    3,- Estudio de la actividad poligalacturonásica en cepas vínicas de Saccharomyces cerevisiae. En las 61 cepas probadas, se halló un gran variabilidad de resultados, para ello se puso a punto un método de cuantificación sencillo y repetitivo empleando ácido poligalacturónico como sustrato. Por otra parte se analizó por PCR y Southern la presencia del gen PGU1, responsable de la actividad poligalacturonásica, mostrando que habían cepas que lo poseían y no expresaban dicha actividad y otras en las que no se amplificaba y que no tenían actividad , por lo que la presencia del gen podrían utilizarse como un marcador genético.

    4,- La cepa que mostró una mayor actividad bajo diferentes parámetros enológicos se utilizó como donante para la transformación de otra vínica con buenas cualidades enológicas y que no poseía el gen PGU1. Se secuenció el gen responsable de la actividad y se halló una mutación a nivel del nucleótido +877: A-G que confiere el cambio de un aminoácido en la secuencia proteínica (Ser293-Gly). Por otra parte se sustituyó el promotor por el del gen PGK1 de S cerevisiae con el fin de aumentar su expresión en condiciones de fermentación.

    La cepa vínica receptora, que adquirió resistencia al sulfometurón metil, se transformó con el fragmento lineal SMR1-PGK1-PGU1 y la integración se dirigió al locus IL V