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Diseño y desarrollo de un derivado fermentado de leche de cabra como alimento funcional. Péptidos bioactivos

  • Autores: Miriam Moreno Montoro
  • Directores de la Tesis: Miguel Navarro Alarcón (codir. tes.), Rafael Giménez Martínez (codir. tes.), Manuel Olalla Herrera (codir. tes.)
  • Lectura: En la Universidad de Granada ( España ) en 2015
  • Idioma: español
  • Tribunal Calificador de la Tesis: Herminia López García de la Serrana (presid.), Ana María Rivas Velasco (secret.), David Rafael Yañez Ruiz (voc.), Beatriz Miralles Buraglia (voc.), Gianluca Piccariello (voc.)
  • Materias:
  • Enlaces
    • Tesis en acceso abierto en: DIGIBUG
  • Resumen
    • SUMMARY 1. Introduction The benefits of goat milk on human health has been demonstrated and compared with other milks as cow or sheep. Specifically, and compared to cow milk, goat milk fat is more digestible and easily absorbed, its proteins are also more digestible, with higher biological value and less allergenic capacity. Additionally, some studies have also reported a better mineral composition and bioavailability for goat milk. (Barrionuevo et al., 2002; Haenlein, 2004; Lopez-Aliaga et al., 2003; Silanikove et al., 2010; Sla¿anac et al., 2010).

      Among dairy products, fermented milks have demonstrated being nutritionally better than others like cheese, cream, butter, etc. with a similar nutritional profile to the milk but more digestible due to its pH and lower lactose concentration. However, in recent years, an increased concern in foods with a positive effect on health beyond their nutritional value has happened. Among them, in fermented milks, much attention has been focused on probiotic products due in part to the fact that this matrix is able to maintain viable the existing bacteria as well as its intake has been daily recommended(Erdmann et al., 2008). Many properties have been attributed to fermented milks and more when probiotics are present, being recommended in the treatment of: lactose intolerance, diarrohea, constipation, Helicobacter pylory, prevention or improvement of infections, immunitary system improvement, atopic eczema, etc. (Baró-Rodríguez et al., 2010; Khani et al., 2012; Sánchez et al., 2009). In this sense, the Lactobacillus genus has a long and safe history in the manufacture of dairy products. For this reason, the putative probiotic strain Lactobacillus plantarum C4, isolated by our research group and with demonstrated antimicrobial, microbiota-modulating and immune-modulating properties, was chosen for the study (Bergillos-Meca, 2014; Bujalance, Moreno, Jimenez-Valera, & Ruiz-Bravo, 2007; Fuentes et al., 2008; Puertollano et al., 2008).

      During the fermentation, and mainly depending on the strains used, different bioactive peptides could be released (Gobbetti et al., 2002). Fermented milks are considered an excellent source of these peptides (Donkor et al., 2007). Biologically active peptides are food-derived peptides that exert (beyond their nutritional value) a physiological, hormone-like effect in humans (Erdmann et al., 2008). Some of these peptides have demonstrated to have antihypertensive, antioxidant, antibacterial, anticancer, immunomodulatory, mineral-binding and opioid activities (Donkor et al., 2007; Korhonen, 2009; Minervini et al., 2003; Muguerza et al., 2006). Bioactive peptides are inactive within the sequence of the precursor protein, being released during gastrointestinal digestion or food processing as fermentation, heating, etc. (Hernández-Ledesma et al., 2004). The bioactive peptides usually contains between 2 and 20 amino acid residues and their activity is inherent to their amino acid composition and sequence, which influences their physicochemical properties as charge or hydrophobicity of a part or the whole peptide (Erdmann et al., 2008). The most widely studied activity of peptides is the angiotensin-I-converting enzyme inhibition, which plays a crucial role in the blood pressure regulation. Despite most of publications on ACEi and antihypertensive peptides have used peptides from cow milk, in recent years goat milk proteins have become an important alternative source for ACEi bioactive peptides (Espejo-Carpio et al., 2013; Haque et al., 2007; Park et al., 2007; Ricci et al., 2010). On the other hand some researchers have stated that antioxidant peptides present in the food system play a vital role in the maintenance of antioxidant defense systems in the organism as well as protecting the food from oxidation (Gupta et al., 2009). Finally, there have been discovered also bioactive peptides with antibacterial activity useful for a further application in industry (Benkerroum, 2010).

      ¿ 2. Rationale and aims of the study Currently, the interest of consumers for their health through the food is increasing, doing so the market of the functional foods. In addition, Andalusia is on the top of goat milk production, being the manufacturing of goat cheese and other dairy products with certified quality, a base for the development of underdeveloped regions. In this context the Excellence Proyect AGR-4915 called ¿Goat milk as a basis for the preparation of fermented milk. Proposal for a functional food¿) was granted to our research group by the Government of Andalusia. Its main objective was the development of one functional fermented goat milk. With this aim this Doctoral Thesis was also purposed , which includes the design and development of one novel fermented goat milk as well as its potential functional activity focused on activities that could be due to its biological peptides.

      Specifically, the general objective of this Thesis has been to develop a novel fermented goat milk its physicochemical, nutritional, organoleptic characterization, peptidic profile and measurement of its functional properties The specific objectives of this Thesis have been: * To establish an adequate milk concentration method for the yoghurt manufacturing.

      * To study the physicochemical and nutritional benefits of the milk concentrated by the chosen concentration method in comparison to the skimmed milk and raw milk.

      * To develop the novel fermented goat milk and to characterize it physicochemically, nutritionally and organoleptically.

      * To identify the peptides produced in the novel fermented goat milk during the fermentation and after its in vitro gastrointestinal digestion in order to find any biologically active peptide or sequence in the identified peptides.

      * To measure the antioxidant, angiotensin-I-converting enzyme inhibitory and antibacterial activity of some fractions of the fermented milk in order to establish its potential benefits.

      3. Results 3.1. Physicochemical and nutritional characteristics of RM, SM and UFM.

      After viscosity and syneresis studies, the ultrafiltration method for milk concentration until 12% of dry extract was chosen because the best viscosity and syneresis of the fermented milks manufactured with this milk were found. The concentration method by ultrafiltration significantly influenced the protein and mineral levels. UFM showed higher concentration of caseins, whey proteins, some minerals (Ca, P, Zn and Cu) ashes, density and acidity than RM and SM, whereas lactose concentration remained almost constant. In addition, mean level of Mg and dry extract were significantly higher than in RM. Regarding the study of mineral distribution in the different protein fractions, mineral levels were found significantly different among them. Additionally, it was observed that ultrafiltration together with pasteurization processes changed the Ca and Mg distribution in the goat milk, increasing the levels present in the soluble portion.

      3.2. Fermented goat milk development and characterization The concentration method was chosen as described above. The viability assays showed us that the cultures used (St and L.plantarum C4) were viable a good concentration at the end of the fermentation, after 4 weeks of storage (>107cfu/mL) and after in vitro gastrointestinal digestion of the fermented milk (St > 107cfu/mL; L. plantarum C4 >108cfu/mL). The physicochemical and nutritional parameters were compared to those reported by some authors for similar samples. In agreement with texture results, in the organoleptic characterization the PFM had a good rheological behaviour and syneresis as well as the best visual parameters for the panellists in comparison to other commercial fermented milks analyzed and it was in overall accepted, similar to those acceptation of commercial fermented milks.

      3.3. Peptide identification before and after in vitro gastrointestinal digestion In overall, 129 peptides were identified, the majority were released from the ß-CN (52%) followed by ¿s1-CN (20%) and ¿s2-CN (16%). Only 12 were released from ¿-CN and 3 from ß-LG. Despite several peptides were identified in milk ultrafiltrate and WSE, most of them were released after in vitro GID. Therefore, we think that L. plantarum C4 could be the responsible of some peptides solubilization, but in spite of this, only few peptides were found only in PFM samples. Some of the identified peptides were previously reported as bioactive peptides or shared any structure homology with these peptides.

      3.4. Biological activity of fermented milk fractions The compounds present in the P<3 fraction showed the highest antioxidant and ACEi activity. However, in the R fraction the antioxidant activity against ABTS and DPPH radicals in comparison with other fractions was noteworthy. On the other hand, WSE and P fractions had weak but significantly antibacterial activity against E. coli in both fermented milks, and R only in the milk fermented with L. plantarum C4. Despite we hypothesized that the small bioactive peptides could be responsible of most of the activities, the WSE of the yoghurt had also an important bioactivity.

      4. Discussion In addition to the general highest mineral and protein concentration of UFM, milk concentration by ultrafiltration has been reported as a good concentration method because it does not affect the nutritional value of the milk, in terms of components modification by heating (Spreer, 1991). Finally, in a different way as when powdered skimmed milk was added, other compounds with molecular weight lower than 50kDa, such as lactose, remained constant.

      The chosen fermentation conditions were 37ºC for around 6 h, time necessary to reach the pH 4.2, which is the isoelectric point of goat caseins (Rojas-Castro et al., 2007). In the fermented milk after 4 weeks of storage, all microorganisms remained viable at higher concentration than the minimum required by the legislation (RD 179/2003). In addition, after the in vitro gastrointestinal digestion, L. plantarum C4 was viable at the necessary concentration for a probiotic strain to exert its function and provide the benefits attributable to it in the consumer (Galdeano et al., 2004; Parvez et al., 2006; Shah, 2007).

      Despite UFM demonstrated differences with the other milks, all physicochemical and nutritional values of PFM were similar to those reported by others for commercial fermented milks. This could be owing to they are usually manufactured with milk concentrated by different methods and it is not usually specified in reported papers. Only the Zn concentration, which is linked to caseins, was higher than most of reported values for commercial fermented milks (De la Fuente et al., 2003; Güler et al., 2009). Finally, its good rheology and syneresis parameters could be attributed to the low fermentation temperature together with the milk concentration in dry extract and specially in proteins and calcium, with not severe heat treatment, and an adequate amount of lactose to reach the desired pH (Domagala et al., 2012). The goat aroma and taste, usually rejected by the consumer, were not highly perceived, probably thanks to the skimming process due to this flavour is associated to the goat fat (Domagala, 2008).

      Peptides release from milk proteins and their activity is influenced by different factors as the animal species and even the breed, milk processing, fermenting bacteria and fermentation conditions (Alo¿lu et al., 2011; Chobert et al., 2005; Li et al., 2013; Uluko et al., 2014). However, the highest proteolysis is not always associated with the highest activity (Virtanen et al., 2007). The highest number of peptides found in GID fractions could be due to the no purification by IEX resin and to the highest proteolysis by digestive poteases (Kopf-Bolanz et al., 2014). Despite the lesser peptides identified in fermented milks WSE, when their fractions were studied, they showed interesting antioxidant and ACEi activity. Different authors associate those activities to the peptides present on it, giving less importance to other water-soluble compounds (Zulueta et al., 2009). However, in the activities measurement of the fermented milk frections, theWSE showed moderate TAC, higher than those reported for the milk and similar ACEi activity to those reported by others for fermented milk (Chobert et al., 2005; Donkor et al., 2007; Hernández-Ledesma et al., 2005; Papadimitriou et al., 2007).

      Reported bioactive peptides usually have less than 20 amino acid residues and the smallest fractions usually present highest biological activities, which is in agreement with our results (Chang et al., 2013; Contreras et al., 2009; Gómez-Ruiz et al., 2006; Quirós et al., 2007; Unal et al., 2012). On the other hand, the high activity of R fraction is supported by Ren et al. (2008), who stated that basic peptides had greater capacity to scavenge hydroxyl radical than acidic or neutral ones. In addition, the antibacterial activity of basic peptides against gram-negative bacteria is well reported (Demers-Mathieu et al., 2013). In that sense, identified peptides were small and some of them had potential bioactivity and could be the responsible of the milk fractions biological activity. The following were the identified sequences with homologous or identical sequence to those with bioactivity such as antihypertensive (ß-CN f[191-205] YQEPVLGPVRGPFPI and ß-CN f[197-207] GPVRGPFPIILV) (Silva & Malcata, 2005), ACEi (¿s1-CN f[157-164] DAYPSGAW, ¿s2-CN f[90-96] VQKFPQY and ß-CN f[191-207] YQEPVLGPVRGPFPILV) (El-Salam & El-Shibiny, 2013; Fitzgerald & Murray, 2006; Robert, Razaname, Mutter, & Juillerat, 2004), antioxidant (ß-CN f[197-206] GPVRGPFPIL) (Sabeena Farvin, Baron, Nielsen, Otte, & Jacobsen, 2010), actibacterial against other non studied bacterial strains (¿s1-CN f[180-193] SDIPNPIGSENSGK and ß-CN f[197-207] GPVRGPFPILV) (Benkerroum, 2010; Losito et al., 2006), immunomodulatory (ß-CN f[191-207] YQEPVLGPVRGPFPILV) (Hernández-Ledesma et al., 2005) opioid (ß-CN f[106-119] HKEMPFPKYPVEPF) (Plaisancié et al., 2013). Most of identified peptides were present in D (absorbed by passive diffusion) and S (soluble) fractions, and then they were able to be absorbed and exert their probable activity in the organism. Those peptides, together with others that shares only a part of the sequence with some identified bioactive peptides, could be the responsible of the activities demonstrated by the fermented milk fractions.

      ¿ 5. Conclusion The new probiotic fermented goat milk developed had adequate physicochemical, nutritional and organoleptic characteristics. It had remarkable antioxidant and angiotensin-I-converting enzyme inhibitory activities, which could be due to the peptides released during the fermentation, some of which showed homologous sequences to peptides with known biological activity. In addition, the release of high amount of peptides, possibly actives, and able to be absorbed after in vitro gastrointestinal digestion, it could lead to its activity in vitro. Therefore, we could consider the developed fermented milk as a healthy alternative to the widely commercialized cow yoghurt.

      RESUMEN 1. Introducción En comparación con otras leches como la de vaca y oveja, la leche de cabra ha demostrado beneficios sobre la salud humana. Más en concreto, comparada con la de vaca, su grasa es más digestible y fácilmente absorbible, sus proteínas además de más digestibles, tienen un mayor valor biológico y son menos alergénicas y por último, algunos estudios han referido una mejor composición y biodisponibilidad mineral (Barrionuevo et al., 2002; Haenlein, 2004; Lopez-Aliaga et al., 2003; Silanikove et al., 2010; Sla¿anac et al., 2010).

      Las leches fermentadas han demostrado ser nutricionalmente mejores que otros derivados lácteos como quesos, nata, mantequilla etc., debido a su valor nutricional similar al de la leche pero con una mayor digestibilidad que la misma gracias a su bajo pH y menor concentración de lactosa. Además, en los últimos años ha aumentado el interés en los alimentos con un efecto positivo sobre la salud más allá de su valor nutricional. Entre ellos, en el campo de las leches fermentadas destacan las probióticas, debido en parte a que esta matriz es capaz de mantener las bacterias viables y a que su consumo se recomienda diariamente (Erdmann et al., 2008). A las leches fermentadas en general, y en particular a las probióticas, se les han atribuido un gran número de propiedades, siendo recomendadas para intolearantes a la lactosa, diarrea, estreñimiento, presencia de Helicobacter pylori, prevención o mejora de infecciones, mejora del sistema inmunitario, eczema atópico, etc. (Baró-Rodríguez et al., 2010; Khani et al., 2012; Sánchez et al., 2009). El género Lactobacillus tiene una larga historia de uso y seguridad en la fabricación de productos lácteos y es por esa razón se eligió la cepa posiblemente probiótica Lactobacillus plantarum C4, aislada por nuestro grupo de investigación y que demostró actividad antimicrobiana y moduladora de la microbiota, así como propiedades inmuno moduladoras (Bergillos-Meca, 2014; Bujalance et al., 2007; Fuentes et al., 2008; Puertollano et al., 2008).

      Durante la fermentación, y principalmente en función de la cepa usada, pueden liberarse diferentes péptidos bioactivos (Gobbetti et al., 2002). Los péptidos biológicamente activos son péptidos derivados de alimentos que ejercen sobre el organismo, más allá de su valor nutricional, un efecto fisiológico similar al hormonal, siendo las leches fermentadas una excelente fuente de los mismos (Donkor et al., 2007; Erdmann et al., 2008). Algunos de estos peptidos han demostrado tener actividades antihipertensiva, antioxidante, antibacteriana, anticáncer, inmuno moduladora y opioide, así como capacidad de unir minerales y reguladora en el síndrome metabólico (Donkor et al., 2007; Korhonen, 2009; Minervini et al., 2003; Muguerza et al., 2006; Ricci-Cabello et al. 2012). Estos péptidos son inactivos en la secuencia proteica, liberándose durante la digestión gastrointestinal o durante el procesado de los alimentos, como es el caso de la fermentación, calentamiento, etc. (Hernández-Ledesma et al., 2004). Los péptidos bioactivos contienen normalmente entre 2 y 20 aminoácidos y su actividad de está basada en su composición y secuencia aminoacídica, de las cuales dependen sus propiedades fisicoquímicas como la carga o la hidrofobicidad (Erdmann et al., 2008). La actividad peptídica más estudiada es la de inhibición de la enzima convertidora de la angiogensina-I (ACEi), que juega un papel crucial en la regulación de la presión sanguínea. A pesar de que la mayor parte de las publicaciones sobre péptidos con actividad ACEi o antihipertensiva han sido realizadas con péptidos procedentes de leche de vaca, en los últimos años las proteínas de leche de cabra están ganando importancia como una fuente alternativa de péptidos con esta actividad (Espejo-Carpio et al., 2013; Haque et al., 2007; Park et al., 2007; Ricci et al., 2010). Por otro lado, algunos investigadores han señalado que los péptidos antioxidantes presentes en los alimentos juegan un papel vital en el mantenimiento de las defensas antioxidantes del organismo, así como en la protección del alimento frente a la oxidación. Finalmente, también se han descubierto péptidos con actividad antibacteriana, útiles para sobre todo para una posterior aplicación en la industria (Benkerroum, 2010).

      2. Razón principal y objetivos del estudio Actualmente está aumentando el interés de los consumidores por mejorar su salud a través de los alimentos, haciéndolo conjuntamente el mercado de los alimentos funcionales. Además, Andalucía está a la cabeza en la producción de leche de cabra, siendo la fabricación de queso de cabra y otros productos lácteos con calidad certificada la base del desarrollo de regiones subdesarrolladas. En este contexto fue concedido por la Junta de Andalucía el proyecto de Excelencia AGR-4195 ¿La leche de cabra como base para la elaboración de un fermentado lácteo. Propuesta de un alimento funcional¿, cuyo objetivo principal fue el desarrollo de un fermentado funcional de leche de cabra. Con este objetivo fue también propuesta la presente Tesis Doctoral, la cual incluye el diseño y desarrollo del nuevo fermentado de leche de cabra y el estudio de su potencial actividad funcional enfocada a las actividades que podrían ser atribuidas a sus péptidos bioactivos.

      En concreto, el objetivo general de esta Tesis ha sido desarrollar una nueva leche fermentada de cabra, su caracterización físico-química, nutricional y organoléptica, perfil peptídico y medida de sus propiedades funcionales.

      Los objetivos específicos han sido los siguientes: * Establecer un adecuado método de concentración de la leche para la elaboración del producto fermentado.

      * Estudiar los beneficios físico-químicos y nutricionales de la leche concentrada por el método elegido en comparación con la leche desnatada y la leche cruda.

      * Desarrollar una nueva leche fermentada de cabra y caracterizarla físico-química, nutricional y organolépticamente.

      * Identificar los péptidos producidos en la nueva leche fermentada de cabra durante la fermentación y después de su digestión gastrointestinal in vitro, con la finalidad de encontrar algún péptido o secuencia biológicamente activos.

      * Medir las actividades antioxidante, inhibidora de la enzima convertidora de la angiotensina-I y antibacteriana de ciertas fracciones de la leche fermentada desarrollada con la finalidad de establecer los posibles beneficios de su ingesta.

      3. Resultados 3.1. Características físico-químicas y nutricionales de RM, SM y UFM.

      Tras los estudios de viscosidad y sinéresis se eligió la concentración por ultrafiltración hasta un 12% de extracto seco como método de concentración debido a la mejor viscosidad y menor sinéresis de las leches fermentadas elaboradas con ella. La concentración mediante ultrafiltración tuvo una influencia significativa sobre los niveles de proteínas y minerales. Esta leche mostró una mayor concentración de caseínas, proteínas séricas, algunos minerales (Ca, P, Zn y Cu), cenizas, densidad y acidez que RM y SM, mientras que la concentración en lactosa permaneció prácticamente constante. Además, los niveles medios de Mg y extracto seco fueron significativamente mayores que en la leche cruda (RM). En cuanto al estudio de la distribución mineral, los niveles de minerales fueron significativamente diferentes entre las fracciones proteicas. Además se observó que la ultrafiltración modificó la distribución de Ca y Mg en la leche, aumentando sus niveles en la porción soluble.

      3.2. Caracterización y desarrollo de la leche fermentada de cabra En primer lugar, la ultrafiltración fue escogida como método de concentración, como se ha descrito anteriormente. Los ensayos de viabilidad mostraron que las tres cepas usadas (St y L.plantarum C4) se mantuvieron viables a una buena concentración al final de la fermentación, después de 4 semanas de almacenamiento (>107ufc/mL) y tras una digestión gastrointestinal in vitro del producto fermentado (St > 107ufc/mL; L. plantarum C4 >108ufc/mL). Los parámetros fisicoquímicos y nutricionales de la PFM se compararon con aquellos referidos por otros autores para muestras similares. En concordancia con los resultados del análisis de textura, en la caracterización organoléptica la PFM mostró un buen comportamiento reológico y de sinéresis, así como los mejores parámetros visuales, obteniendo una buena aceptación general, similar a las leches comerciales analizadas.

      3.3. Identificación de los péptidos antes y después de la digestión gastrointestinal in vitro.

      En general se identificaron 129 péptidos, la mayoría liberados de la ß-CN (52%), seguidos los liberados de la ¿s1-CN (20%) y la ¿s2-CN (16%). Sólo 12 fueron liberados de la ¿-CN y 3 de la ß-LG. A pesar de que se identificaron algunos péptidos en el ultrafiltrado de la leche y en el WSE de las leches fermentadas, la mayoría fueron liberados después de la digestión gastrointestinal in vitro. Por otro lado pensamos que L. plantarum C4 podría ser el responsable de la solubilización de algunos péptidos, pero a pesar de ello, sólo unos cuantos péptidos fueron identificados únicamente en las leches fermentadas con el probiótico.

      3.4. Actividad biológica de las fracciones de la leche fermentada Los compuestos presentes en la fracción P<3 mostraron la mayor actividad antioxidante y ACEi. Sin embargo, la actividad antioxidante frente a los radicales ABTS y DPPH de la fracción R fue importante en relación a las otras fracciones. Poro otro lado, mostraron una baja, aunque significativa, actividad antibacteriana frente a E. coli, las fracciones WSE y P de ambas leches fermentadas y R de la PFM. A pesar de la hipótesis de que los péptidos bioactivos de tamaño pequeño podrían ser los responsables de la mayor parte de las actividades, el WSE del yogur mostró también una importante bioactividad.

      4. Discusión Además del mayor contenido en minerales y proteínas de la UFM, este tipo de concentración ha sido referida como un buen método también porque que no afecta al valor nutricional de la leche en cuanto a la modificación de sus componentes por el calentamiento (Spreer, 1991). Finalmente, a diferencia de cuando se adiciona leche en polvo, otros compuestos de peso molecular menor de 50kDa, como la lactosa, permanecen constantes.

      Las condiciones de fermentación elegidas fueron 37ºC durante aproximadamente 6 h, tiempo suficiente para alcanzar un pH de 4.2, al cual se encuentra el punto isoeléctrico de las caseínas de cabra (Rojas-Castro et al., 2007). En la leche fermentada, tras 4 semanas de almacenamiento, todos los microorganismos permanecieron viables a niveles superiores al mínimo necesario exigido por la legislación (RD 179/2003). Además, tras la digestión gastrointestinal in vitro, L. plantarum C4 se mantuvo viable a la concentración necesaria para que una cepa probiótica pueda ejercer sus funciones y proveer al consumidor de los beneficios que se le atribuyen (Galdeano et al., 2004; Parvez et al., 2006; Shah, 2007).

      A pesar de que la leche concentrada por ultrafiltración demostró diferencias con las otras leches, todos los parámetros físico-químicos y nutricionales de la leche fermentada elaborada con ella fueron similares a aquellos reportados en bibliografía para leches fermentadas comerciales. Esto podría ser debido a que la mayoría están elaboradas con leches concentradas por diferentes métodos que normalmente no se especifican en los artículos donde se analizan. Solamente la concentración de Zn, mineral unido a caseínas, fue mayor que la mayoría de los valores referidos para leches fermentadas comerciales (De la Fuente et al., 2003; Güler et al., 2009). Finalmente, sus buenos parámetros reológicos y de sinéresis podrían deberse a la baja temperatura de fermentación junto con la concentración de la leche en extracto seco y especialmente en proteínas y calcio, sin un severo tratamiento térmico, y con una adecuada cantidad de lactosa para poder alcanzar el pH deseado (Domagala et al., 2012). El aroma y sabor a cabra, normalmente rechazados por los consumidores, no fueron muy percibidos, probablemente gracias al proceso de desnatado ya que este flavor está asociado a la grasa de la leche de cabra. (Domagala, 2008).

      La liberación de los péptidos de las proteínas de la leche así como su actividad están influenciada por distintos factores como: la especie animal e incluso la raza, el procesado de la leche, los fermentos bacterianos y las condiciones de fermentación (Alo¿lu et al., 2011; Chobert et al., 2005; Li et al., 2013; Uluko et al., 2014). Sin embargo, una mayor proteólisis no está siempre asociada a una mayor actividad (Virtanen et al., 2007). El mayor número de péptidos encontrado tras la digestión gastrointestinal in vitro podrí ser debido a la no purificaron con la resina de intercambio iónico y a la mayor proteólisis llevada a cabo por las proteasas digestivas (Kopf-Bolanz et al., 2014). A pesar de identificar menos péptidos en WSE con respecto a los digeridos, las fracciones del WSE mostraron una interesante actividad antioxidante y ACEi. Diversos autores asocian esas actividades a los péptidos presentes en ellas, dando menor importancia a otros compuestos hidrosolubles (Zulueta et al., 2009). Sin embargo, en la medida de las actividades de las fracciones de las leches fermentadas, el WSEmostró una moderada capacidad antioxidante total, mayor a la referida para la leche y una actividad ACEi similar a aquella referida por otros investigadores para leches fermentadas (Chobert et al., 2005; Donkor et al., 2007; Hernández-Ledesma et al., 2005; Papadimitriou et al., 2007).

      Los péptidos bioactivos normalmente tienen menos de 20 amino ácidos y las fracciones de menor tamaño normalmente presentan mayores actividades biológicas, lo que concuerda con nuestros resultados (Chang et al., 2013; Contreras et al., 2009; Gómez-Ruiz et al., 2006; Quirós et al., 2007; Unal et al., 2012). Por otro lado, actividad antioxidante de la fracción R está sustentada por Ren et al. (2008), quien manifestó que los péptidos básicos tienen una mayor capacidad de captar los radicales hidroxilo que los péptidos ácidos o neutros. Además, la actividad antibacteriana de los péptidos básicos frente a bacterias gran negativas es bien conocida (Demers-Mathieu et al., 2013).

      En este sentido, los péptidos identificados fueron de tamaño pequeño y algunos de ellos fueron potencialmente bioactivos, pudiendo ser los responsables de la actividad biológica de las fracciones. Los siguientes péptidos fueron identificados con secuencia homóloga o idéntica a péptidos referidos en bibliografía con actividades como antihipertensiva (ß-CN f[191-205] YQEPVLGPVRGPFPI y ß-CN f[197-207] GPVRGPFPILV) (Silva et al., 2005), ACEi (¿s1-CN f[157-164] DAYPSGAW, ¿s2-CN f[90-96] VQKFPQY y ß-CN f[191-207] YQEPVLGPVRGPFPILV) (El-Salam et al., 2013; Fitzgerald et al., 2006; Robert et al., 2004), antioxidante (and ß-CN f[197-206] GPVRGPFPIL) (Farvin et al., 2010), antimicrobiana frente a otras bacterias no estudiadas en esta investigación (¿s1-CN f[180-193] SDIPNPIGSENSGK y ß-CN f[197-207] GPVRGPFPILV) (Benkerroum, 2010; Losito et al., 2006), immunomoduladora (ß-CN f[191-207] YQEPVLGPVRGPFPILV) (Hernández-Ledesma et al., 2005) y opioide (ß-CN f[106-119] HKEMPFPKYPVEPF) (Plaisancié et al., 2013). La mayoría de éstos fueron identificados en la fracción D (absorbida por difusión pasiva) y S (soluble), teniendo la capacidad de ser absorbidos y ejercer su actividad en el organismo. Estos péptidos, junto con otros que comparten sólo una parte de la secuencia identificada como activa en bibliografía, podrían ser los responsables de las actividades demostradas por las fracciones de las leches fermentadas.

      Conclusión El nuevo fermentado probiótico de leche de cabra desarrollado presenta unas características físico-químicas, nutricionales y organolépticas adecuadas. Son destacables en él la actividad antioxidante e inhibidora de la enzima convertidora de la angiotensina-I, que podrían ser debidas a los péptidos liberados durante la fermentación, algunos de los cuales presentan secuencias aminoacídicas comunes a péptidos con actividades biológicas conocidas. Además, la liberación de una gran cantidad de péptidos posiblemente bioactivos y con capacidad de ser absorbidos tras la digestión gastrointestinal in vitro, podría implicar la actividad de los mismos in vivo. Por tanto, podríamos considerar la leche fermentada desarrollada como una alternativa saludable al yogur de vaca ampliamente comercializado.

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