Microbiome-based analytical approaches and biopreservation agents for improving meat quality and safety

• Autores: Coral Barcenilla Canduela
• Directores de la Tesis: Avelino Álvarez Ordóñez (dir. tes.), Miguel Prieto Maradona (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de León ( España ) en 2024
• Idioma: inglés
• Número de páginas: 112
• Títulos paralelos:
  • Evaluación de metodologías de análisis de microbiomas y agentes de bioconservación para la mejora de la calidad y seguridad de carne y productos cárnicos
• Tribunal Calificador de la Tesis: Juan Miguel Rodríguez Gómez (presid.), Sara Bover Cid (secret.), Catherine Burgess (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Ciencias Veterinarias y de los Alimentos por la Universidad de León
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: BULERIA
• Resumen
  • español

    La carne fresca y los ambientes de procesado de la carne pueden albergar una amplia variedad de microorganismos. Pueden encontrarse a lo largo de las líneas de procesado, en las materias primas, productos finales y en las superficies en contacto y de no contacto con los alimentos. Cuando los microorganismos se añaden como cultivos iniciadores, son beneficiosos ya que desempeñan funciones importantes, como por ejemplo dirigir procesos de fermentación o competir con microorganismos perjudiciales. Por el contrario, otros microorganismos son alterantes o patógenos, siendo perjudiciales para la calidad y seguridad de los productos cárnicos.

    En general, el estudio de los microorganismos en la industria alimentaria se ha abordado mediante metodologías basadas en su cultivo en el laboratorio, aunque en los últimos años se han producido nuevos avances y mejoras que han conducido a la aplicación de metodologías más exhaustivas que proporcionan información sobre el microbioma completo de los alimentos. Las tecnologías de secuenciación de alto rendimiento (HTS, por sus siglas en inglés) ofrecen ventajas sobre las metodologías clásicas dependientes de cultivo. Sin embargo, en general siguen estando infrautilizadas en la industria alimentaria y, en particular, en el sector cárnico. El objetivo de los tres primeros capítulos experimentales de esta Tesis Doctoral era desarrollar métodos y protocolos basados en HTS para estudiar la composición y función del microbioma de la carne y sus ambientes de procesado asociados. Brevemente, el Capítulo I describe un procedimiento para estudiar el microbioma de los ambientes de procesado de la carne mediante secuenciación del metagenoma completo. Aborda la estrategia de muestreo en la industria y el procedimiento para la extracción de ADN metagenómico total, con un protocolo mejorado para aumentar el rendimiento teniendo en cuenta la baja concentración microbiana que se puede encontrar en las plantas de procesado después de la limpieza y desinfección. El protocolo puede obtener cantidades de ADN superiores a 10 ng en más del 98% de las muestras y permite la obtención de una media de 12,2 genomas ensamblados a partir de metagenomas por muestra, lo que mejora notablemente otras alternativas disponibles. El Capítulo II presenta y discute los resultados obtenidos de la validación del protocolo descrito en el Capítulo I en diecinueve industrias cárnicas para caracterizar las comunidades microbianas que prevalecen específicamente en la carne, los productos cárnicos y sus ambientes de procesado. Se observó que las especies bacterianas pertenecientes a los géneros Pseudomonas, Staphylococcus, Brochothrix, Acinetobacter y Psychrobacter dominaron en todos los tipos de muestras, siendo la especie Pseudomonas fragi y varias del género Psychrobacter las más abundantes en los ambientes de procesado. También se encontró una gran diversidad de presuntas nuevas especies en ambientes de procesado de carne, lo que demuestra la existencia de una importante diversidad microbiana aún por investigar. El Capítulo III se centra en el desarrollo de una metodología mejorada para el estudio de integrones de clase I, basado en la amplificación y secuenciación mediante tecnología de lecturas largas. Su uso para la caracterización del resistoma asociado a estos elementos genéticos en la carne, los productos cárnicos y sus ambientes de procesado permitió la caracterización de integrones de clase I con hasta 7 genes de resistencia a antibióticos diferentes, principalmente relacionados con la resistencia a aminoglicósidos, betalactámicos y antagonistas del folato.

    Teniendo en cuenta que la carne y los productos cárnicos pueden ser el origen de ciertos patógenos alimentarios vinculados con riesgos para la salud pública y la seguridad alimentaria, urge la necesidad de validar nuevas estrategias de conservación y control de patógenos que sean eficaces en la industria cárnica. Además, la tendencia actual hacia alimentos producidos de forma más natural impulsa la búsqueda de alternativas a los aditivos convencionales. Las bacterias lácticas (BAL) son una buena alternativa como agentes de bioconservación de alimentos por ser generalmente reconocidas como seguras y por su potencial efecto antimicrobiano frente a patógenos de origen alimentario. El objetivo de los tres últimos capítulos de esta Tesis Doctoral era diseñar y validar estrategias de bioconservación basadas en el uso de BAL para mejorar la calidad y seguridad de productos cárnicos. En el Capítulo IV se evalúa la combinación de un cultivo iniciador comercial con altas presiones hidrostáticas (APH) para controlar el crecimiento de Listeria monocytogenes y Salmonella Typhimurium en un embutido fermentado (chorizo de León). La aplicación de HPP en las primeras etapas de maduración, solo o en combinación con el cultivo iniciador, que contenía Pediococcus acidilactici, Latilactobacillus sakei y Staphylococcus carnosus, permitió el control de L. monocytogenes y S. Typhimurium, con reducciones de hasta 4,8 y 2,4 unidades logarítmicas, respectivamente, sin afectar adversamente la calidad físico-química o sensorial. El Capítulo V describe la selección de tres cepas de BAL (Lactococcus lactis, Lacticaseibacillus paracasei y Lactiplantibacillus plantarum), en función de su aptitud como agentes antilisteria en diferentes productos cárnicos, y su posterior evaluación en jamón cocido en combinación con envasado al vacío, envasado en atmósfera modificada y HPP. Por último, el Capítulo VI se centra en el estudio del efecto de las cepas de BAL previamente seleccionadas para controlar L. monocytogenes en carne de cerdo marinada. Los ensayos de desafío realizados en jamón cocido y en carne de cerdo marinada evidenciaron que el cóctel de BAL fue capaz de adaptarse a la matriz alimentaria y dominar sobre el resto de microorganismos durante el almacenamiento, controlando el crecimiento de L. monocytogenes y de algunas bacterias alterantes como Brochothrix, sin efectos adversos notables sobre las características físico-químicas o sensoriales de los productos.

    En conclusión, los seis capítulos experimentales que forman esta Tesis Doctoral contribuyen a la obtención de productos cárnicos seguros mediante estrategias combinadas de control microbiológico, utilizando metodologías de secuenciación del ADN como herramienta innovadora para estudiar el microbioma de los productos cárnicos y sus ambientes de procesado asociados, y aplicando agentes de bioconservación capaces de modular el microbioma de productos cárnicos.

  • English

    Meat and meat processing environments can host a wide range of microorganisms. They can be found all along the processing lines, in raw materials, final products, food contact and non-food contact environments. When added as starter cultures, they are beneficial as they carry out important functions, for example leading fermentation processes or competing against harmful microorganisms. On the contrary, others are spoilers or pathogens, being detrimental for the quality and safety of meat products.

    Generally, the study of microorganisms in the food chain has been approached through classical culture-dependent methodologies, although in the last years new developments and improvements have led to the increased implementation of more comprehensive methodologies providing information on whole food microbiomes. High-throughput sequencing (HTS) technologies offer several advantages over culture-dependent methodologies. However, they are still underutilised in general in the food industry, and particularly in meat production systems. The objective of the first three experimental chapters of this PhD Thesis was to develop HTS methods and protocols to study the composition and function of the microbiomes of meat and associated processing environments. Briefly, Chapter I describes a procedure to study through whole metagenome sequencing the resident microbiome of meat processing environments. It covers the sampling strategy in the industry and the approach for extraction of total metagenomic DNA, with an improved protocol to increase the yield considering the low microbial biomasses that can be found in processing plants after cleaning and disinfection. The protocol can yield DNA loads >10 ng in >98% of samples and allows the collection of, on average, 12.2 metagenome assembled genomes (MAG) per sample, which markedly improves other available alternatives. Chapter II presents and discusses the results obtained during the validation of the protocol described in chapter I for mapping the microbial communities prevailing specifically in meat, meat products, and associated processing environments of 19 meat processing facilities. It shows that bacterial species belonging to the genera Pseudomonas, Staphylococcus, Brochothrix, Acinetobacter and Psychrobacter dominated across sample types, with Pseudomonas fragi and different Psychrobacter species being found as the most abundant core species in processing environments. It also highlights the occurrence of a high diversity of putative new species in meat processing environments, demonstrating an important microbial diversity still to be unravelled. Chapter III is focused on the development of a novel approach for the study of class I integrons, based on their amplification and sequencing using long-read nanopore technology. Its use for the characterization of the resistome associated with these genetic elements in meat, meat products, and associated processing environments allowed the resolution in single reads of class I integrons containing up to 7 different antimicrobial resistance genes, mainly linked to resistance to aminoglycosides, betalactams and folate pathway antagonists.

    On the basis that meat can be the source of some foodborne pathogens associated with public health and food safety risks, there is an urging need to validate novel effective strategies of preservation and pathogen control in the meat industry. In addition, the current trend towards naturally produced foods is promoting the search for new alternatives to traditional preservative additives. Lactic acid bacteria (LAB) are good candidates as food biopreservative agents, due to their generally safety qualification and their promising antimicrobial effect against foodborne pathogens. The objective of the last three chapters of the PhD Thesis was to design and validate biopreservation strategies based on the use of LAB to improve the quality and safety of meat products. Chapter IV presents a study evaluating the combination of a commercial starter culture with High-Pressure Processing (HPP) to control the growth of Listeria monocytogenes and Salmonella Typhimurium in a dry fermented sausage (chorizo de León). The application of HPP in the early stages of ripening, alone or in combination with a starter culture containing Pediococcus acidilactici, Latilactobacillus sakei and Staphylococcus carnosus, achieved a successful control of Listeria monocytogenes and S. Typhimurium, with log reductions of up to 4.8 and 2.4, respectively, and no adverse effects regarding physico-chemical or sensory quality attributes. Chapter V describes the screening and selection of three LAB strains (Lactococcus lactis, Lacticaseibacillus paracasei and Lactiplantibacillus plantarum), based on their aptitude to be employed as antilisterial agents in different meat products, and their further assessment in cooked ham in combination with vacuum packaging, modified atmosphere packaging and HPP. Finally, Chapter VI is focused on the study of the performance of the previously selected LAB strains to control L. monocytogenes in a marinated pork product. The detailed challenge tests undertaken with the cocktail of the three LAB strains in ready-to-eat cooked meat products and marinated pork showed that the LAB cocktail was able to adapt to the food matrix and dominate over the background microbiota during storage, demonstrating control over L. monocytogenes and some spoilage-associated taxa such as Brochothrix, without noticeable adverse effects on the physico-chemical or sensorial characteristics of the products.

    Altogether, the six experimental chapters included in this thesis contributes to provide solutions to obtain safer meat products through combined mitigation strategies, using next generation sequencing methodologies as an innovative tool to study the microbiome of meat products and associated processing environments, and applying biopreservative agents capable of modulating the microbiome of selected meat products.