Biofilm formation by microorganisms of interest in food industries: intraspecies variability, biomarkers and control strategies based on non-thermal atmospheric plasma technologies
- Autores: Paula Fernández Gómez
- Directores de la Tesis: Miguel Prieto Maradona (dir. tes.), Avelino Álvarez Ordóñez (dir. tes.), Mercedes López Fernández (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de León ( España ) en 2022
- Idioma: inglés
- Número de páginas: 81
- Títulos paralelos:
- Formación de biopelículas por microorganismos de interés en la industria alimentaria: variabilidad intraespecífica, biomarcadores y estrategias para su control mediante tecnologías basadas en plasma atmosférico no térmico
- Tribunal Calificador de la Tesis: Romain Briandet (presid.), Daniel Berdejo (secret.), Bélen Orgaz Martin (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Ciencias Veterinarias y de los Alimentos por la Universidad de León
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: BULERIA
- Resumen
- español
Las comunidades microbianas que colonizan los ambientes de procesado de alimentos en forma de biopelículas tienen un gran impacto en la calidad y seguridad de los alimentos. Por lo tanto, el estudio de los factores que influyen en la formación, la ecología y la arquitectura de las biopelículas de microorganismos patógenos y alterantes es clave para el desarrollo de nuevas estrategias de control o eliminación de biopelículas. En la presente Tesis Doctoral se examinó la variabilidad intraespecífica en cuanto a la capacidad de formación de biopelículas y otras características fenotípicas en una amplia colección de aislados de varios microorganismos de interés en la industria alimentaria.
La importancia del regulador general de la respuesta a estrés de las bacterias Gram negativas, RpoS, en la formación de biopelículas se evaluó en nueve aislados de Cronobacter sakazakii. Su capacidad de formación de biopelículas se evaluó en BHI y medios mínimos con diferentes valores de pH y suplementados o no con los aminoácidos arginina, lisina y ácido glutámico, resultando ésta generalmente mayor en medios mínimos tamponados (pH 7,0) suplementados con lisina, a pesar de la heterogeneidad existente entre las diferentes cepas. La formación de biopelículas se visualizó mediante microscopía de barrido láser confocal y microscopía electrónica de barrido y se midió mediante determinación espectrométrica del cristal violeta fijado, mostrando niveles más altos de formación de biopelículas sobre acero inoxidable que sobre poliestireno. Se pudo apreciar una menor capacidad para formar biopelículas en una cepa con una mutación que resulta en la pérdida de función del gen rpoS, en comparación con el resto de las cepas estudiadas, que portan un gen rpoS funcional. La complementación de esta cepa con un gen rpoS funcional aumentó su capacidad de formación de biopelículas hasta niveles similares a los de las cepas con un gen rpoS funcional después de 24 h de incubación. Las diferencias observadas se redujeron cuando se utilizó una incubación de 48 h. Estos resultados indican que la pérdida del factor RpoS provoca un retraso en el desarrollo de biopelículas maduras, pero no una inhibición completa de la producción de biopelículas en C. sakazakii.
También se evaluó la funcionalidad del regulador RpoS y la capacidad de formación de biopelículas en una colección de treinta y una cepas de Escherichia coli productoras de β-lactamasas de espectro extendido (BLEE), aisladas de alimentos de origen animal y de pacientes humanos, y cepas de colección de referencia, junto con su tolerancia a condiciones de estrés comunes en la cadena alimentaria (calor, ácido, plasma atmosférico no térmico (PANT) y luz UV-C). Solo se observaron diferencias menores asociadas a la presencia de los genes BLEE blaTEM, blaCTX-M y blaSHV, y no se encontraron mutaciones en el gen rpoS que conllevaran una pérdida de función. Las diferencias fenotípicas más relevantes se observaron para la formación de biopelículas y la resistencia al calor, siendo los aislados alimentarios significativamente más resistentes a los tratamientos térmicos a 58 oC durante 1 y 2 minutos que los aislados clínicos. Además, la capacidad de formación de biopelículas sobre acero inoxidable fue significativamente mayor para los aislados de campo, tanto de origen clínico como alimentario, que para las cepas de referencia.
Asimismo, se caracterizó una colección de treinta y tres cepas de Pseudomonas spp. aisladas de instalaciones de procesado de alimentos en cuanto a la funcionalidad del regulador RpoS, la actividad catalasa, la pigmentación en medio sólido, la producción de pioverdina, la hidrofobicidad celular y la formación de biopelículas sobre acero inoxidable, poliestireno y vidrio, con el fin de encontrar biomarcadores de fuerte producción de biopelículas. Los niveles de formación de biopelículas sobre acero inoxidable y poliestireno fueron significativamente más altos para las cepas con pigmentación verde en comparación con las cepas marrones o no pigmentadas. Las posibles relaciones entre la producción de pioverdina, la pigmentación de las colonias y la disponibilidad de hierro se estudiaron utilizando un secuestrador de hierro, 2,2-bipiridina, que provocó una disminución del 40 % en la formación de biopelículas por parte de las cepas no pigmentadas. Para la mayoría de los posibles biomarcadores estudiados, la heterogeneidad fenotípica observada entre las cepas dependía principalmente de la asignación taxonómica de la cepa de Pseudomonas (P. aeruginosa frente a otras especies de Pseudomonas). Sin embargo, la pigmentación verde de las colonias en medio sólido se identificó como un posible biomarcador de fuerte formación de biopelículas.
Durante esta Tesis Doctoral, se evaluaron dos estrategias de control de biopelículas basadas en la tecnología del plasma. La primera se centró en el desarrollo de recubrimientos anti-biopelícula que eviten la adherencia bacteriana a las superficies mediante modificaciones físico-químicas. Se aplicaron diferentes recubrimientos de (3 aminopropil)trietoxisilano (APTES), ortosilicato de tetraetilo (TEOS) y ácido acrílico (AA) mediante plasma atmosférico no equilibrado sobre acero inoxidable AISI 316. Se evaluó su actividad anti-biopelícula frente a biopelículas de L. monocytogenes CECT911 y E. coli CECT515 tras la incubación a 37 oC. Los dos mejores recubrimientos, AP10+TE6 y AP10+AA6, que redujeron la producción de biopelículas de L. monocytogenes en un 45 % y un 74 %, respectivamente, en comparación con el acero inoxidable sin recubrimiento, se seleccionaron para una caracterización más detallada junto con una modificación de esos recubrimientos, AP10+SA6. Se estudió la actividad anti-biopelícula frente a dos cepas de L. monocytogenes aisladas de una industria cárnica y a temperaturas de incubación más bajas, representativas de ambientes de procesado de alimentos, obteniendo los mejores resultados para el recubrimiento AP10+AA6, que redujo la formación de biopelículas en un 90 %. después de la incubación a 12 oC. La caracterización morfológica y físico-química de los recubrimientos seleccionados mostró que el recubrimiento más efectivo, AP10+AA6, presentaba una menor rugosidad superficial y mayor hidrofilicidad, característica que se vio favorecida por las condiciones de baja temperatura, cuando la humectabilidad de las cepas fue mayor. En conjunto, estos resultados sugieren la formación de una capa de hidratación que impide la adherencia de las células de L. monocytogenes a la superficie recubierta.
Se continuó con la caracterización del recubrimiento AP10+AA6 estudiando su actividad anti-biopelícula frente a biopelículas multiespecies que contienen L. monocytogenes (desarrolladas a partir de la microbiota autóctona de tres industrias cárnicas diferentes) y evaluando la eficacia desinfectante y evolución de las biopelículas tras la higienización con dos biocidas empleados en la industria alimentaria, utilizando enfoques dependientes e independientes del cultivo. Se observó una menor efectividad del recubrimiento frente a L. monocytogenes en los biofilms multiespecie desarrollados durante 7 días a 12 oC, además de un control parcial, y dependiente de la industria, del crecimiento del patógeno. La composición taxonómica de la biopelícula dependió en gran medida de la industria, pero no se vio afectada por la naturaleza de la superficie (acero inoxidable sin revestimiento o con revestimiento) o por la inoculación artificial con L. monocytogenes. Las biopelículas formadas durante 7 días a 12 oC después de los tratamientos de desinfección de 15 min mostraron una menor diversidad taxonómica y el hipoclorito sódico, aunque fue ligeramente menos efectivo que el ácido peracético inmediatamente después de la aplicación, permitió un mejor control del crecimiento de L. monocytogenes en las biopelículas multiespecies desarrolladas. Esto sugiere que una desinfección capaz de preservar las relaciones competitivas interespecíficas entre los miembros de la microbiota autóctona y L. monocytogenes podría ser más favorable para el control a largo plazo de este patógeno en las instalaciones de procesado de alimentos.
La segunda tecnología basada en plasma evaluada en la presente Tesis Doctoral fue el uso de agua activada por plasma (PAW) como estrategia de control alternativa para la inactivación de L. monocytogenes. Se generaron diferentes PAWs a través de la activación del agua del grifo utilizando un plasma de descarga de barrera dieléctrica superficial (SDBD) funcionando con diferentes condiciones de potencia de descarga (26 y 36 W) y tiempo de activación (5 y 30 min). El estudio de composición físico-química (pH y niveles de peróxido de hidrógeno, nitratos y nitritos) y eficacia antimicrobiana frente a un cóctel de tres cepas de L. monocytogenes en estado planctónico permitió identificar las mejores condiciones de generación de PAW, que fueron 36 W de potencia de descarga con 30 min de tiempo de activación (PAW HM30). La actividad antimicrobiana de esta PAW frente a biopelículas de L. monocytogenes fue menor que en estado planctónico, donde se lograron reducciones logarítmicas de 4,6, pero aun así se pudieron obtener reducciones logarítmicas de 1,9 y 1,8 después de 15 minutos de exposición para las biopelículas formadas en acero inoxidable y en poliestireno, respectivamente. Los mecanismos de inactivación del PAW se investigaron mediante el análisis por ARN-seq de L. monocytogenes después de su tratamiento con PAW HM30. Los principales cambios en la expresión génica afectaron el metabolismo del carbono, algunos genes de virulencia y la respuesta general al estrés, perteneciendo varios de los genes más sobreexpresados al cluster de genes dependientes de la cobalamina, previamente relacionado con la patogenicidad de L. monocytogenes y su respuesta a múltiples condiciones de estrés.
- English
Microbial communities colonizing food processing environments in the form of biofilms have a major impact on food quality and safety. Therefore, the understanding of factors influencing the formation, ecology and architecture of biofilms from pathogenic and spoilage microorganisms is key for the development of novel biofilm control or removal strategies. In the present PhD Thesis, the intraspecific variability regarding biofilm formation ability and other phenotypic characteristics was examined in a wide collection of isolates from several microorganisms of interest in the food industry.
The importance of the general stress response regulator of Gram-negative bacteria RpoS on biofilm formation was assessed in nine field isolates of Cronobacter sakazakii. Their biofilm formation ability was screened in BHI and minimum media with different pH values and supplemented or not with the amino acids arginine, lysine and glutamic acid, resulting generally higher in buffered minimum media (pH 7.0) supplemented with lysine, despite the existing heterogeneity among the different strains. Biofilm formation was visualized by confocal laser scanning microscopy and scanning electron microscopy and was measured by spectrometric determination of the fixed crystal violet, with higher biofilm formation levels being obtained on stainless steel plates than on polystyrene. A lower ability to form biofilms was found for a strain with a loss-of-function mutation in the rpoS gene compared to the rest of the strains, which harboured a functional rpoS. The complementation of this strain with a functional rpoS gene increased it biofilm formation ability up to levels similar to the strains with a naturally functional rpoS gene after 24 h of incubation. However, the differences observed were reduced when a 48 h incubation was used. These results indicate that the loss of RpoS caused a delay in the development of mature biofilms, rather than a complete inhibition of biofilm production in C. sakazakii.
Also, the RpoS status and biofilm formation ability was evaluated in a collection of thirty-one extended-spectrum β-lactamase (ESBL)-producing Escherichia coli strains isolated from foods of animal origin and from human patients, and reference collection strains, together with their tolerance to food-associated stresses (heat, acid, non-thermal atmospheric plasma (NTAP) and UV-C light). Only minor differences were associated to the carriage of the ESBL genes blaTEM, blaCTX-M and blaSHV and no loss-of-function mutations were found in the rpoS gene. The most relevant phenotypic differences among strains were observed for biofilm formation and heat resistance, with food isolates being significantly more resistant to heat treatments at 58 oC for 1 and 2 min than clinical isolates. Also, the biofilm formation ability on stainless steel was significantly higher for the field isolates, both clinical- and food-related, than for the reference strains.
A collection of thirty-three Pseudomonas spp. isolates from food processing facilities was also investigated regarding their RpoS status, catalase activity, pigmentation on solid media, pyoverdine production, cellular hydrophobicity and biofilm formation on stainless steel, polystyrene and glass, in order to find biomarkers of strong biofilm production. The biofilm formation levels on stainless steel and polystyrene were significantly higher for the green-pigmented strains as compared to brown or not pigmented strains. Possible relations between pyoverdine production, colony pigmentation and iron availability were studied using an iron scavenger, 2,2-bipyridine, resulting in a decrease of 40 % in biofilm formation for the not pigmented strains. For most of the potential biomarkers studied, the phenotypic heterogeneity observed among strains was mainly dependent on the Pseudomonas species (P. aeruginosa vs other Pseudomonas species). However, the green colony pigmentation on solid media was identified as a potential biomarker of strong biofilm formation.
During this PhD thesis, two plasma-based biofilm control strategies were evaluated. The first one focussed on the development of anti-biofilm coatings that prevent bacterial adherence to the surfaces through physico-chemical modifications. Different coatings made of (3 aminopropyl)triethoxysilane (APTES), tetraethyl orthosilicate (TEOS) and acrylic acid (AA) were applied by Non-Equilibrium Atmospheric Plasma on stainless steel AISI 316. Their anti-biofilm activity was assessed against biofilms of L. monocytogenes CECT911 and E. coli CECT515 after incubation at 37 oC. The two best coatings, AP10+TE6 and AP10+AA6, that reduced L. monocytogenes biofilm production by 45 % and 74 %, respectively, when compared with the uncoated stainless steel, were selected for a further characterization together with a modification of those, AP10+SA6. The anti-biofilm activity was studied against two L. monocytogenes strains isolated from a meat industry and at lower incubation temperatures, more representative of food processing environments, obtaining the best results for the coating AP10+AA6, that reduced the biofilm formation by 90 % after incubation at 12 oC. The morphological and physico-chemical characterization of the selected coatings showed that the most anti-biofilm coating, AP10+AA6, presented the lower surface roughness and higher hydrophilicity, a characteristic that was enhanced by low temperature conditions, when the wettability of the strains was increased. Altogether, these results suggest the formation of a hydration layer that prevents the adherence of L. monocytogenes cells to the coated surface.
The characterization of the coating AP10+AA6 continued through the study of its anti-biofilm activity against multispecies biofilms containing L. monocytogenes (developed using indigenous microbiota from three different meat industries) and by assessing the disinfection effectiveness and biofilm evolution after sanitization with two food industry biocides, using culture-dependent and culture-independent approaches. A lower effectiveness of the coating against L. monocytogenes when inoculated in the multispecies biofilms developed for 7 days at 12 oC was observed, together with a partial and industry dependent control of the growth of the pathogen. The biofilm taxonomic composition was highly dependent on the industry, but it was not affected by the nature of the surface (uncoated vs coated stainless steel) and the artificial inoculation with L. monocytogenes. The biofilms formed after 7 days at 12 oC following the 15-min disinfection treatments showed reduced taxonomic diversity and, although sodium hypochlorite was slightly less effective than peracetic acid immediately after application, it caused a stronger growth control of the naturally present L. monocytogenes on the multispecies biofilms developed. This suggested that that a sanitization able to preserve interspecific competitive relationships between the members of the indigenous microbiota and L. monocytogenes might be more favourable for the long-term control of this pathogen in food processing facilities.
The second plasma-based technology evaluated in the current PhD Thesis was the use of plasma-activated water (PAW) as an alternative control strategy for L. monocytogenes inactivation. Different PAWs were generated through the activation of tap water using a surface dielectric barrier discharge (SDBD) plasma working at different conditions of discharge power (26 and 36 W) and activation time (5 and 30 min). The study of their physico-chemical composition (pH and levels of hydrogen peroxide, nitrates and nitrites) and antimicrobial efficacy against a cocktail of three L. monocytogenes strains on planktonic state allowed the identification of the best PAW generation conditions, i.e. 36 W of discharge power with 30 min of activation time (PAW HM30). The antimicrobial activity of this PAW against three-strain L. monocytogenes biofilms was lower than in the planktonic state, where 4.6 log reductions were achieved, but still able to obtain 1.9 and 1.8 log reductions after 15 min of exposure of biofilms formed on stainless steel and on polystyrene, respectively. The mechanisms of PAW inactivation were investigated through RNA-seq analysis of L. monocytogenes after its treatment with PAW HM30. The main transcriptomic changes affected carbon metabolism, some virulence genes and the general stress response, with several of the most overexpressed genes belonging to the cobalamin-dependent gene cluster, previously related to L. monocytogenes pathogenicity and its response to multiple stressors.
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