Control del flujo catabólico de aminoácidos en Lactococcus lactis y evaluación de la formación de compuestos volátiles

• Autores: María Luz Pérez Gómez de Cadiñanos
• Directores de la Tesis: Teresa Requena Rolanía (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2012
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Manuela Juárez Iglesias (presid.), Mónica Rodríguez García-Risco (secret.), Margarita Medina Fernández-Regatillo (voc.), Jan Kok (voc.), Baltasar Mayo Pérez (voc.)
• Materias:
  • Física
    • Química física
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Biblos-e Archivo
• Resumen

  • Las actividades enzimáticas de las bacterias lácticas implicadas en el catabolismo de aminoácidos hasta la formación de potentes compuestos volátiles, juegan un papel fundamental en el desarrollo del aroma de los quesos. Las rutas de degradación de aminoácidos en Lactococcus lactis se inician por una reacción de transaminación que conduce a la formación de ¿-cetoácidos, los cuales constituyen el metabolito central de bifurcación entre las rutas biosintéticas y catabólicas y son limitantes en la formación de aroma. Estos ¿-cetoácidos serán posteriormente transformados en compuestos volátiles, como los aldehídos, ácidos carboxílicos y ésteres; aunque también pueden producirse hidroxiácidos, que son compuestos que no participan en el aroma. La eficiente conversión de ¿-cetoácidos hasta compuestos volátiles podría conseguirse aumentando la disponibilidad de ¿- cetoglutarato como aceptor de grupos amino en la reacción de transaminación a través de la actividad glutamato deshidrogenasa (GDH) y bloqueando la ruta de conversión de ¿-cetoácidos a los correspondientes hidroxiácidos.

    El objetivo principal de esta Tesis Doctoral ha sido la utilización de estrategias enzimáticas relacionadas con el catabolismo de aminoácidos y encaminadas al control de la formación de compuestos volátiles por L. lactis.

    En este estudio se llevó a cabo la determinación de la presencia del gen gdh y la caracterización de la actividad GDH a partir de estirpes silvestres de L. lactis procedentes de quesos de leche cruda. Los resultaron indicaron que es una actividad poco frecuente en L. lactis, ya que sólo se encontró en 10 cepas de las 41 estudiadas. Las cepas con actividad GDH mostraron preferencia por NAD+ como cofactor en la reacción, indicando un papel fundamentalmente catabólico de la actividad GDH en estas cepas. En todas las cepas con actividad GDH, el gen gdh tenía una localización plasmídica. Se seleccionó del estudio la cepa L. lactis IFPL953 por su elevada actividad GDH con preferencia para la formación de ¿-cetoglutarato y por presentar una organización genética del gen gdh equivalente a la de L. lactis Til504, empleada en este estudio como referencia de actividad GDH.

    Con objeto de aumentar la disponibilidad de ¿-cetoácidos por L. lactis y optimizar su degradación hasta compuestos volátiles, se bloqueó la ruta de conversión de ¿-cetoácidos a los correspondientes hidroxiácidos mediante la inactivación del gen panE en L. lactis IFPL953. El gen panE codifica la enzima hidroxiisocaproato deshidrogenasa (Hic-DH), que posee la principal actividad ¿- cetoácido deshidrogenasa de L. lactis. La mutación del gen panE se llevó a cabo mediante mutagénesis por doble sobrecruzamiento, y condujo a la pérdida total de actividad Hic-DH en la cepa mutante L. lactis IFPL953¿panE. Además, se analizó la capacidad de L. lactis para formar compuestos volátiles mediante microextracción en fase sólida y cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (SPME y GC-MS). Esto nos permitió obtener un perfil aromático con mayor formación de aldehídos, ácidos carboxílicos y compuestos volátiles totales en la cepa mutante que el encontrado en la cepa silvestre. La inactivación de panE en L. lactis IFPL953, caracterizada por poseer actividades GDH, AraT, BcaT y KivD, dio lugar a la acumulación de ¿-cetoisocaproato y al aumento de 3-metilbutanal y 3-metilbutanol.

    L. lactis IFPL953¿panE resultó ser más eficiente que la cepa parental en la formación de compuestos volátiles relacionados con el aroma del queso.

    Para profundizar en el conocimiento del catabolismo de aminoácidos en L.

    lactis, estudiamos la expresión de los genes que codifican enzimas clave en el catabolismo de aminoácidos en condiciones de crecimiento variando el contenido de aminoácidos ramificados (BCAAs) y simulando condiciones de maduración del queso. Para ello, el estudio se centró en la expresión de los genes araT, bcaT, gdh, kivD, ytjE y panE y se analizó mediante transcripción inversa y PCR a tiempo real.

    Además, se establecieron las diferencias de expresión génica por la ausencia del gen panE. Adicionalmente, se estudió la capacidad de formar compuestos volátiles en el medio mediante SPME y GC-MS. La limitación de BCAAs en el medio de crecimiento de L. lactis provocó el incremento de la expresión de todos los genes en estudio, especialmente en los genes gdh y kivD. Estos cambios indican que la expresión de estos genes está regulada por CodY. Del mismo modo, pudimos observar que la incubación de L. lactis en condiciones que simulan la maduración del queso, en especial la falta de azúcar en el medio, provocaron cambios significativos en la expresión de los genes gdh y kivD. En todas las condiciones de incubación, la inactivación del gen panE provocó un incremento de la expresión del gen gdh. Los cambios observados a nivel genético repercutieron en la capacidad de L. lactis para producir compuestos volátiles en las condiciones estudiadas. El análisis de los perfiles de volátiles producidos por L. lactis mostraron que la estirpe mutante en actividad Hic-DH, L. lactis IFPL953¿panE, fue más eficiente en el catabolismo de aminoácidos que la cepa parental, obteniéndose un incremento en la producción de compuestos volátiles procedentes del catabolismo de los BCAAs, como 2- y 3-metilbutanal y sus correspondientes alcoholes.

    El trabajo desarrollado en esta Tesis Doctoral nos ha permitido profundizar en el estudio del catabolismo de aminoácidos en L. lactis. Mediante la inactivación de la actividad Hic-DH en una cepa silvestre con elevadas actividades GDH y KivD se ha logrado incrementar el flujo catabólico de aminoácidos hacia la formación de compuestos representativos del aroma en queso