Development of molecular approaches for direct detection and quantification of wine-related microorganisms
- Autores: Verónica Soares Santos
- Directores de la Tesis: Isabel Pardo Cubillos (dir. tes.), Sergi Ferrer Soler (codir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de València ( España ) en 2018
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Rosa Aznar Novella (presid.), José Manuel Guillamón Navarro (secret.), David Rodríguez Lázaro (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biomedicina y Biotecnología por la Universitat de València (Estudi General)
- Materias:
- Texto completo no disponible (Saber más ...)
- Resumen
En esta tesis doctoral se han desarrollado procedimientos para la detección y cuantificación de levaduras y bacterias acéticas totales y, en concreto, de las especies más importantes en la vinificación como Saccharomyces cerevisiae, Brettanomyces bruxellensis, Zygosaccharomyces bailii, L. plantarum, y O. oeni. Las estrategias que se han utilizado para el desarrollo de nuevos métodos se centran fundamentalmente en la supresión del paso de extracción previa de ADN y de los procedimientos de eliminación de inhibidores de la reacción de PCR presentes en las muestras.
Para llevar a cabo este objetivo general, se establecieron los siguientes objetivos específicos; 1, desarrollo de un método de qPCR que permita la detección y la cuantificación de células enteras de microorganismos del vino, independientemente de si éstas están en un estado viable o no; 2, desarrollo de un método de qPCR que permita la detección y cuantificación de células viables de microorganismos del vino, para lo cual se requiere el tratamiento previo con propidio de monoazida (PMA) de las células presentes en una muestra; 3, desarrollo de un método basado en la técnica loop-mediated isothermal amplification (LAMP) para la detección de células enteras de microorganismos del vino, independientemente de si éstas están en un estado viable o no; 4, desarrollo de un método LAMP cuantitativo para la detección y cuantificación de células enteras de microorganismos del vino, independientemente de si éstas están en un estado viable o no.
Los procedimientos desarrollados permiten realizar la detección y cuantificación de las células enteras de esos grupos microbianos o de las especies concretas sin necesidad de recurrir a la extracción del DNA y directamente a partir de mostos, de vinos o de medios de cultivo. Además, la matriz de la cual provengan las células (medios de cultivo, mostos o vinos, tanto blancos como tintos) no inhibe las reacciones de PCR y LAMP. Ello es particularmente importante en el caso de los vinos tintos, donde se encuentran polifenoles y etanol, descritos frecuentemente como inhibidores de las polimerasas. Los límites de detección y cuantificación, y las eficiencias obtenidas en mostos y vinos fueron similares a los obtenidos en medio de cultivo. Los métodos desarrollados permiten la detección y cuantificación de células (tanto totales como vivas y muertas) en un plazo de tiempo que varía entre 1 y 5 horas. Estos procedimientos se han aplicado para la detección y cuantificación de levaduras y bacterias de mostos y vinos producidos industrialmente.
