Efecto de las altas presiones hidrostáticas en la desnaturalización de las proteínas del lactosuero bovino
- Autores: Chafiaa Mazri
- Directores de la Tesis: Lourdes Sánchez Paniagua (dir. tes.), María Dolores Pérez Cabrejas (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Zaragoza ( España ) en 2012
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Santiago Condón Usón (presid.), María Pilar Mañas Pérez (secret.), Carlos J. González Navarro (voc.), Vicente Sanchís Almenar (voc.), Luisa María Martín Cabrejas (voc.)
- Materias:
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- Resumen
Las proteínas del lactosuero son muy utilizadas en la industria alimentaria tanto por sus propiedades tecnológicas como por sus propiedades biológicas (Baker et al., 1987, Morr y Ha, 1993). Estas propiedades dependen en muchos casos de su estabilidad y de las interacciones que establecen con otros componentes durante el procesado de la leche (López-Fandiño, 2006b, Anema 2009). Por ello, es importante conocer el efecto que los tratamientos tecnológicos tienen sobre su estructura y funcionalidad.
El método habitual de higienización de la leche consiste en la aplicación de tratamientos térmicos. Sin embargo, dichos tratamientos tienen también efectos adversos como son la pérdida de algunos componentes nutritivos y la modificación de las propiedades organolépticas (Considine, 2007). Asimismo, el calor induce la desnaturalización y la agregación de las proteínas del lactosuero, lo cual puede producir modificaciones en sus propiedades funcionales (Anema, 2009).
Con el objeto de evitar estos efectos adversos, en los últimos años se están desarrollando sistemas alternativos de higienización de los alimentos que sustituyan de forma ventajosa al calor. Estos sistemas de procesado incluyen, entre otros, las altas presiones hidrostáticas. La aplicación de las altas presiones a la leche se centra esencialmente en su capacidad para destruir la flora patógena y alterante sin afectar el sabor, el aroma y el valor nutricional del producto original.
En los productos lácteos, además de la estabilización microbiológica de la leche, las altas presiones han resultado ser eficientes en la mejora de las propiedades de los productos lácteos obtenidos. En la industria quesera, el tratamiento de la leche con altas presiones como sustitución de los tratamientos de pasterización, favorece la coagulación, mejora el rendimiento quesero y produce una textura más firme y menos fracturable (Trujillo et al., 2002). Además, el tratamiento de la leche con altas presiones mejora la resistencia a la rotura y reduce la sinéresis del yogur firme (Johnston et al., 1992, Ferragut et al., 2000) e incrementa la viscosidad del yogur batido en comparación con la leche tratada térmicamente. Las altas presiones mejoran también las propiedades de la nata para montar (Eberhard et al., 1999) y la textura de los helados (Keenan et al., 1998). Por otra parte, las altas presiones son capaces de afectar a la estructura de las proteínas, induciendo cambios en las interacciones intra e intermoleculares de los grupos funcionales de los aminoácidos. Las presiones superiores a 200-300 MPa a temperatura ambiente provocan la disociación de las macroestructuras en subunidades, así como la desnaturalización de las estructuras monoméricas, probablemente debido al debilitamiento de las interacciones hidrofóbicas y electrostáticas. Sin embargo, salvo que las presiones sean muy elevadas, los enlaces por puentes de hidrógeno y sobre todo los enlaces covalentes no se ven afectados por estos tratamientos (Hendrickx, 1998).
El potencial de aplicación de los tratamientos con altas presiones de la leche tambien se atribuye, en parte, a su efecto en las propiedades físico-químicas de las proteínas del lactosuero (López-Fandiño, 2006a; Considine et al., 2007).
El estudio del efecto que esta tecnología tiene sobre las proteínas del lactosuero ha estado dirigido sobre todo a las dos proteínas mayoritarias, la ¿-lactoglobulina y la ¿-lactalbúmina (Hinrichs y Rademacher, 2004; Huppertz et al., 2004; Anema et al., 2005) por ser las que determinan las propiedades tecnológicas del lactosuero, tales como emulsificación, viscosidad, gelificación, capacidad espumante o ligante. En los estudios realizados, el grado de desnaturalización de estas dos proteínas por efecto de la presión se ha estimado utilizando técnicas electroforéticas (Anema et al., 2005), cromatográficas (Felipe et al, 1997; Hinrichs y Rademacher, 2004; Huppertz et al., 2004) y espectrofotométricas (Ikeuchi et al., 2001; Yang et al., 2001) entre otras.
La ¿-lactoglobulina presenta una alta sensibilidad frente a la presión mientras que la ¿-lactalbúmina es mucho más barorresistente (Hupertz et al., 2004). Las modificaciones que se producen en la estructura de estas proteínas por efecto de la presión permiten mejorar las propiedades tecnológicas de los productos que las contienen. Así, el tratamiento con altas presiones de la ¿-lactoglobulina a pH neutro da lugar a la formación de geles cuya fuerza se incrementa con la presión, la temperatura y el tiempo de tratamiento (Ipsen et al., 2002). En la ¿-lactalbúmina, el tratamiento con altas presiones mejora sus propiedades espumantes y la estabilidad de las espumas (Rodiles-Lopez et al., 2008). Por lo tanto, las proteínas del lactosuero pueden ser procesadas con altas presiones para mejorar sus propiedades tecnológicas y extender sus usos en la industria alimentaria.
Otras proteínas minoritarias del lactosuero bovino, tales como las inmunoglobulinas, la lactoferrina o la lactoperoxidasa tienen un especial interés debido a sus propiedades biológicas, fundamentalmente a su capacidad antimicrobiana. Estas proteínas muestran una alta sensibilidad frente a los tratamientos térmicos por lo que son desnaturalizadas en parte en algunos procesos de pasterización de la leche, lo que conlleva una pérdida de sus propiedades biológicas. Sin embargo, existen pocos estudios sobre el efecto que las altas presiones tienen sobre estas proteínas minoritarias. Por lo tanto, la aplicación de tratamientos de higienización que mantengan las propiedades biológicas de estas proteínas del lactosuero es un tema de gran interés para la industria alimentaria, dada su posible utilización como ingredientes funcionales con valor añadido en la elaboración de numerosos alimentos destinados a poblaciones especiales como niños, ancianos o enfermos inmunodeprimidos (Sánchez et al., 1992a; Wolfson y Sumner, 1993).
OBJETIVOS En la Tesis que se presenta, se ha planteado como objetivo global determinar el efecto que los tratamientos con altas presiones tienen en la desnaturalización de las proteínas del lactosuero bovino.
Para llevar a cabo este objetivo global, se han planteado los siguientes objetivos parciales:
- Estudiar el efecto que las altas presiones hidrostáticas tienen sobre la estructura de las proteínas del lactosuero bovino: ¿-lactoglobulina, ¿-lactalbúmina, IgG y lactoferrina y sobre la actividad del enzima lactoperoxidasa, tratando las proteínas en tres medios diferentes (leche, lactosuero y tampón), a diferentes presiones y tiempos.
- Determinar los parámetros cinéticos de la desnaturalización de dichas proteínas por acción de las altas presiones hidrostáticas en los tres medios estudiados.
- Estudiar el efecto que tienen tratamientos térmicos de pasterización de diferente intensidad sobre la desnaturalización de las proteínas del lactosuero.
- Estudiar el efecto de la adición de diferentes reactivos al medio de tratamiento en la desnaturalización térmica y por altas presiones de las proteínas del lactosuero, con el objeto de obtener información sobre el mecanismo de acción de dicha desnaturalización.
METODOLOGÍA La metodología desarrollada para el cumplimiento de los objetivos propuestos ha incluido los siguientes apartados: - Obtención de antisueros frente a las proteínas del lactosuero bovino: ¿-lactoglobulina, ¿-lactalbúmina, IgG y lactoferrina mediante inoculación en conejos de las proteínas purificadas.
- Desarrollo de técnicas de inmunodifusión radial para la determinación de las proteínas ¿-lactoglobulina, ¿-lactalbúmina e IgG.
- Desarrollo de una técnica de ELISA de tipo sándwich para la determinación de lactoferrina bovina. Para ello, los anticuerpos específicos se aislaron de los antisueros por inmunoadsorción utilizando una columna de lactoferrina insolubilizada en Sepharose 4B y se conjugaron con el enzima peroxidasa por el método del periodato.
- Desarrollo de una técnica colorimétrica para determinar la actividad enzimática de la lactoperoxidasa utilizando ABTS como sustrato.
- Determinación de la concentración de ¿-lactoglobulina, ¿-lactalbúmina, IgG y lactoferrina inmunorreactivas y de la actividad enzimatica de la lactoperoxidasa tras someterlas a tratamientos de pasterización de diferente intensidad o a tratamientos con altas presiones (450-700 MPa) a diferentes tiempos a 20ºC, en tres medios diferentes: leche, lactosuero y tampón fosfato, así como en presencia y ausencia de determinados reactivos (glecerol, N-etelmaleímida e iodato potasico). Con los resultados obtenidos, calcular los parámetros cinéticos de su desnaturalización (valores D y Z, constantes de desnaturalización, k, y volúmenes de activación, Va) por efecto de las altas presiones en los tres medios.
APORTACIONES A continuación, se muestran las aportaciones más revelantes obtenidas en este trabajo.
Los resultados obtenidos muestran que existen diferencias marcadas en la sensibilidad de las proteínas del lactosuero frente a las altas presiones. La lactoperoxidasa es la proteína que ha mostrado la mayor barorresistencia entre las proteínas estudiadas, ya que su actividad se mantiene estable tras el tratamiento de la leche a todas las presiones y tiempos aplicados. La ¿-lactalbúmina es también una proteína con una alta estabilidad, ya que su concentración disminuye menos de un 20% tras el tratamiento más intenso aplicado a la leche (700 MPa, 15 minutos). Por ello, no ha sido posible calcular los parámetros cinéticos de la desnaturalización de estas dos proteínas.
Las IgG muestran también una considerable resistencia frente al tratamiento con altas presiones al ser tratadas en leche, siendo sus valores k menores que los de la lactoferrina y la ¿-lactoglobulina a todas las presiones estudiadas. La ¿-lactoglobulina ha resultado ser la proteína más sensible frente a la presión cuando es tratada en leche en el intervalo entre 450 y 600 MPa. A 650 MPa, la barorresistencia de la ¿-lactoglobulina y la lactoferrina son similares y a 700 MPa, la lactoferrina se desnaturaliza más rápidamente siendo su valor K aproximadamente el doble que el de la ¿-lactoglobulina. Esta diferente sensibilidad en función de la presión aplicada queda reflejada en los valores Z obtenidos que son aproximadamente el doble para la¿¿-lactoglobulina que para la lactoferrina.
Por otra parte, cuando se trataron con altas presiones las muestras de lactosuero obtenido por coagulación enzimática o las proteínas purificadas disueltas en tampón fosfato, se observaron diferencias en su velocidad de desnaturalización con respecto a lo obtenido en leche, lo que indica que el medio de tratamiento influye en su barorresistencia. La ¿-lactoglobulina y la ¿-lactalbúmina se desnaturalizan más lentamente en el lactosuero que en la leche y sobre todo a las presiones más bajas. Sin embargo, la lactoferrina y las IgG son más sensibles a la presión en el lactosuero que en la leche. Al tratar las proteínas en tampón fosfato, se observó que la ¿-lactoglobulina y la lactoferrina muestran una mayor barorresistencia que en leche y lactosuero, mientras que las IgG muestran una sensibilidad similar a la obtenida en la leche.
La adición a la leche y al lactosuero de N-etilmaleimida, un agente bloqueante de los grupos sulfidrilo antes de la presurización previene la desnaturalización de la ¿-lactoglobulina, la lactoferrina y las IgG. Sin embargo, la adición de iodato potasico reduce la estabilidad de la ¿-lactoglobulina frente a la presión, pero incrementa la estabilidad de las otras proteínas. Estos resultados sugieren que en el tratamiento con las altas presiones, el grupo sulfidrilo libre de la ¿-lactoglobulina desencadena reacciones de intercambio sulfidrilo-disulfuro con otras proteínas del lactosuero, lo que conduce a la formación de agregados de proteínas del lactosuero mediante interacciones covalentes por puentes disulfuro. La adición de glicerol a la leche o al lactosuero previene también la desnaturalización de las proteínas estudiadas por efecto de las altas presiones, hecho que parece deberse a que se favorecen las interacciones hidrofóbicas, así como a los cambios producidos en la solvatación de las proteínas.
La cinética de la desnaturalización de la ¿-lactoglobulina, la lactoferrina y las IgG, por efecto de las altas presiones sigue un orden de reacción de n=1,5 y lleva consigo una disminución del volumen aparente de las proteínas estudiadas.
Por otra parte, los tratamientos de pasterización aplicados a la leche, lactosuero o proteínas puras en tampón han mostrado que de entre las proteínas estudiadas, la ¿-lactalbúmina es la proteína más termorresistente, seguida de la ¿-lactoglobulina. La lactoperoxidasa es la proteína que ha mostrado la mayor sensibilidad frente al calor y la lactoferrina y las IgG presentan una termorresistencia intermedia.
CONCLUSIONES Las principales conclusiones derivadas de este trabajo pueden resumirse en: - Las proteínas del lactosuero muestran una resistencia muy diferente frente a los tratamientos con altas presiones y a los tratamientos térmicos dependiendo de la proteína considerada.
- La ¿-lactoglobulina es la proteína del lactosuero más sensible al tratamiento con altas presiones. La lactoferrina y las IgG muestran una estabilidad frente a la presión mayor que la ¿-lactoglobulina. La ¿-lactalbúmina y sobre todo la lactoperoxidasa son proteínas muy barorresitentes.
- La lactoperoxidasa es la proteína del lactosuero más sensible a los tratamientos de pasterización, seguida de la lactoferrina y las IgG. La ¿-lactoglobulina y particularmente la ¿-lactalbúmina son proteínas que presentan una alta termorresistencia.
- El medio de tratamiento influye marcadamente en la barorresistencia de las proteínas del lactosuero. La ¿-lactoglobulina y la ¿-lactalbúmina son más estables al ser tratadas en tampón que en lactosuero y en ambos medios más que en leche. La lactoferrina es más resistente al ser tratada en tapón que en leche y mucho mas que en el lactosuero. Las IgG muestran una similar estabilidad al ser tratadas en tampón que en leche y una mayor sensibilidad en lactosuero. La lactoperoxidasa es resistente a la presión en los tres medios estudiados.
- El mejor ajuste del proceso cinético de desnaturalización por las altas presiones de las proteínas del lactosuero ¿-lactoglobulina, lactoferrina e IgG se obtiene asumiendo un orden de reacción de n = 1,5. Los parámetros cinéticos determinados en este trabajo permiten predecir el grado de desnaturalización de las proteínas estudiadas tratadas en leche, lactosuero y tampón en base a las presiones y tiempos de tratamiento a ser aplicados.
