Obtención y purificación de enzimas implicadas en la determinación de colesterol: colesterol oxidasa y nadh peroxidasa
- Autores: Amparo Sarabia Meseguer
- Directores de la Tesis: Francisco García Carmona (dir. tes.), Álvaro Sánchez Ferrer (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Murcia ( España ) en 2002
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Romualdo Muñoz Giron (presid.), Catalina Egea Gilabert (secret.), Juana Mercedes Cabanes Cos (voc.), José Manuel López Nicolás (voc.), Antonia Murcia Maria (voc.)
- Materias:
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- Resumen
Desde la perspectiva de búsqueda de fuentes alternativas para determinar la concentración de colesterol, tanto en suero como en alimentos, han sido estudiadas dos enzimas oxidativas, colesterol oxidasa y NADH peroxidasa.
La enzima coleterol oxidasa fue aislada de Streptomyces lividans 1326 pCO-3. En primer lugar fue realizada la optimización del cultivo del microorganismo siendo los valores 2 vvm de aireación y 600 rpm de agitación los óptimos encontrados para la producción de la enzima. Colesterol oxidasa fue posteriormente purificada a homogeneidad en un solo paso cromatográfico, utilizando una columna de afinidad con colesterol consiguiéndose una purificación de 8,91 veces y una actividad específica de 28,6.
Por último, el gen choA productor de la enzima colesterol oxidasa fue clonado en Pichia pastoris GS115, lográndose la integración de este heterólogo en el genoma de la levadura. La producción máxima de la enzima fue conseguida tras añadir al medio de cultivo una concentración de metanol del 3% y mantener las condiciones de aireación y agitación respectivamente en 2.5 vvm y 250 rpm mediante la utilización de un fermentador.
Por otro lado, la enzima NADH peroxidasa fue aislada de la bacteria Aerococcus viridans ATCC 11563. Las condiciones óptimas de producción de la enzima fueron obtenidas en medios con glucosa como fuente de carbono y catalasa, coincidiendo con un valor nulo de peróxido de hidrógeno en el medio extracelular. Posteriormente, la enzima fue purificada a homogeneidad mediante un protocolo que combinó la extracción con lisozima, precipitación con sulfato amónico, una columna de interacción hidrofóbica y una columna de hidroxiapatilo, de tal forma que la actividad específica encontrada fue de 114 con un purificación de 21,8. Tras la realización del análisis molecular de la enzima, el peso molecular hallado mediante la técnica de filtración en gel fue de 215.000 Da. Debido a que en
