Caracterización genética y funcional de la bacteria probiótica pediococcus parvulus 2.6

• Autores: Adrián Pérez
• Directores de la Tesis: Mari Luz Mohedano Bonillo (dir. tes.), Paloma López García (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Complutense de Madrid ( España ) en 2019
• Idioma: español
• Títulos paralelos:
  • Genetic and functional characterization of the probiotic bacterium pediococcus parvulus 2.6
• Tribunal Calificador de la Tesis: Juan Miguel Rodríguez Gómez (presid.), Juana María Navarro Llorens (secret.), Patricia Rúas Madiedo (voc.), María Jesús Yebra Yebra (voc.), Djamel Drider (voc.)
• Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Bioquímica, Biología Molecular y Biomedicina por la Universidad Complutense de Madrid
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Docta Complutense
• Resumen

  • Los ß-glucanos, especialmente aquellos con enlaces ß-(1,3) pueden actuar como inmunomoduladores ejerciendo efectos beneficiosos sobre la salud humana. Así también, son utilizados como sustitutivos a los tratamientos antibióticos en industrias como la acuicultura y la ganadería.

    En algunas bacterias lácticas se ha descrito la producción un (1,3)-ß-glucano ramificado en posición O-2. Pediococcus parvulus 2.6 es el prototipo de bacteria productora de este ß-glucano, en la cual, se han investigado sus características físico-químicas, su producción y su influencia en el metabolismo bacteriano. El objetivo de esta tesis se centra en la profundización de la influencia del polímero en el metabolismo bacteriano, así como en la influencia sobre las propiedades probióticas de la bacteria.

    En P. parvulus 2.6 hemos descrito la presencia de la agrupación genética gutFRMCBA (operón gut), cuyos genes están implicados en la utilización del sorbitol. Por lo tanto, la utilización del sorbitol como fuente de carbono para el metabolismo de P. parvulus fue investigada. Además, el análisis de los flujos metabólicos y la producción del sorbitol en esta bacteria han demostrado que el sorbitol puede actuar como precursor para la producción del ß-glucano.

    Nos hemos valido del vector pRCR, basado en la expresión del gen mrfp que codifica la proteína fluorescente mCherry, para investigar la regulación transcripcional de la expresión del operón gut. Para la realización de este estudio, la posible secuencia promotora (Pgut) así como los dos genes que codifican posibles reguladores (GutR y GutM) fueron clonados, produciendo fusiones transcripcionales con el gen mrfp. El estudio se llevó a cabo en dos huéspedes heterólogos, Lactobacillus plantarum y Lactobacillus casei, que también utilizan el sorbitol. Los resultados mostraron una trans-complementación en la activación de Pgut en L. plantarum en presencia de sorbitol, pero no así en L. casei. Los resultados también indicaron que GutR es un activador transcripcional y que GutM es necesaria para el correcto funcionamiento de Pgut.

    Las propiedades probióticas de P. parvulus han sido investigadas usando modelos in vivo de pez cebra. Para ello, las cepas fueron marcadas fluorescentemente mediante la transferencia del plásmido pRCR12, lo que permitió su detección en el interior del tracto gastrointestinal (TGI) del pez cebra, debido a la producción constitutiva de la mCherry. Además, se llevó a cabo un modelo de infección con el patógeno Vibrio anguillarum. Los resultados mostraron que las dos cepas recombinantes fueron capaces de colonizar el TGI del pez cebra y contrarrestar los efectos infectivos del patógeno, y además, la estirpe productora del ß-glucano lo hizo de una manera más eficaz, poniendo en valor el efecto positivo del polímero.

    Por otra parte, el modelo del pez cebra fue utilizado para estudiar la modulación del sistema inmune innato por parte del ß-glucano pediocócico. Los resultados mostraron una reducción en la expresión genética de la IL8, TNF¿ y MyD88 en las células inmunes del pez cebra. Posteriormente, la línea transgénica de pez cebra Tg(mpx:GFP), cuyos neutrófilos expresan constitutivamente la proteína GFP, fue utilizada para desarrollar un modelo de inflamación inducida. La exposición de las larvas al ß-glucano bacteriano provocó una reducción significativa del reclutamiento y proliferación de los neutrófilos. Estos resultados mostraron el potencial del ß-glucano pediocócico como un agente antiinflamatorio.

    Finalmente, se investigó la capacidad de las cepas de P. parvulus para fermentar matrices alimentarias basadas en avena, cebada y arroz, con el objetivo de desarrollar nuevos alimentos funcionales. P. parvulus no fue capaz de fermentar la matriz de cebada, sin embargo fermentó las matrices de arroz y avena, esta última más eficazmente. Se detectó en las matrices la producción del ß-glucano por la cepa 2.6, lo que provocó un incremento de la viscosidad de las matrices.