Biodesulfuración de fracciones petrolíferas con "pseudomonas putida" CECT5279: optimización del proceso
- Autores: Raúl Alonso del Águila
- Directores de la Tesis: Eloy García Calvo (dir. tes.), Ana Karina Boltes Espínola (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Alcalá ( España ) en 2010
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Félix García-Ochoa Soria (presid.), Pedro Letón García (secret.), Montserrat Tobajas Vizcaíno (voc.), Jose Luis Garcia Lopez (voc.), Victoria Eugenia Santos Mazorra (voc.)
- Materias:
- Enlaces
- Resumen
- español
La normativa ambiental europea (Dir. 2003/17/CE 2009) ha obligado a reducir el contenido de azufre en los combustibles fósiles a niveles inferiores a 10 ppm. Actualmente, el uso de métodos fisicoquímicos, como la hidrodesulfuración en serie, permite alcanzar estos niveles, pero a un elevado coste, ya que son necesarias condiciones de trabajo muy severas. El tratamiento biológico de una fracción previamente hidrodesulfurada, reduciría los costes, ya que permitiría trabajar en unas condiciones de operación más suaves. Los procesos de biodesulfuración se basan en el empleo de microorganismos como biocatalizadores para eliminar de forma selectiva el azufre de los compuestos aromáticos que los contienen. En este trabajo se ha utilizado un microorganismo genéticamente modificado, Pseudomonas putida CECT5279, al cual se le han clonado genes procedentes de E.Coli y R..erythropolis IGTS8, confiriéndole resistencia a la tetraciclina y la capacidad desulfurante. Esta bacteria es capaz de metabolizar los compuestos aromáticos azufrados, tales como dibenzotiofeno (DBT) y sus derivados alquilados, dando lugar a la formación del correspondiente compuesto libre de azufre, a través de la ruta 4S, en la se produce una ruptura del enlace C-S sin alterar el anillo aromático del compuesto. En este trabajo se han estudiado en profundidad, una serie de factores que son de gran relevancia de cara a la aplicación industrial del proceso en utilizando células en parada de crecimiento (resting cell) en medio bifásico. En primer lugar, se llevo a cabo el estudio de la producción del microorganismo en biorreactor tipo air-lift, Se optimizaron las condiciones de aireación, obteniéndose las células de máxima capacidad desulfurante al cabo de 12 horas de crecimiento, siendo rendimientos de desulfuración obtenidos aproximadamente el doble que los alcanzados en tanque agitado. Se llevó a cabo la caracterización del consumo y transporte de oxígeno en estas condiciones de trabajo y se relacionó con el desarrollo de la capacidad desulfurante. Por otra parte, debido a la necesidad de utilizar una elevada cantidad de células para el proceso de biodesulfuración en resting cell en tanque agitado, se realizó el cambio de escala de la producción del biocatalizador, utilizando un tanque agitado de 15L. El cambio de escala se ha basado en el mantenimiento del coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno, para lo que fue necesario realizar un estudio previo de las condiciones de agitación y aireación en el tanque. Se realizó de forma satisfactoria el cambio de escala, consiguiéndose una elevada cantidad de células sin pérdida de la capacidad desulfurante, en comparación con el protocolo ya existente a escala de tanque agitado de 2L. En una segunda fase del trabajo, se llevó a cabo el estudio cinético de degradación decompuestos modelo como DBT y sus derivados alquilados (4MDBT, 4,6DMDBT y 4,6DEDBT), en distintas condiciones de trabajo: medio acuoso y bifásico, así como en distintas escalas de trabajo: agitador orbital y tanque agitado de 2L, siempre en condiciones de resting cell. Los ensayos se realizaron utilizando los distintos compuestos de manera individual y mezclados. En todos los ensayos, se pudo observar como los compuestos de menor grado de alquilación obtenían mayores velocidades de degradación y mayor rendimiento de conversión, independientemente de la escala y medio de reacción empleado. Por otro lado, se llegó a la conclusión de que las mezclas de compuestos Cx-DBT, dificultaban el proceso de biodesulfuración, reduciendo así su velocidad de degradación y el rendimiento de conversión de estos compuestos. Una vez estudiado el proceso de biodesulfuración para las muestras modelo, se llevó a cabo el estudio cinético de degradación de una muestra real de hidrodesulfurado, cedida por la empresa Repsol-YPF. Previamente, fue necesario identificar y cuantificar los compuestos más abundantes: DBT, 4MDBT y 4,6DMDBT, utilizándose los patrones externos disponibles comercialmente. Se observó que la degradación de estos compuestos seguía la misma tendencia que en el caso de las muestras modelo, de modo que se observaba una mayor degradación para los compuestos de menor grado de degradación, obteniéndose los mayores rendimientos de conversión para DBT, siendo este el compuesto más abundante, y por tanto, eliminándose de forma satisfactoria este tipo de compuestos. En otra fase del trabajo, se abordó el problema de la baja velocidad del proceso de biodesulfuración, en la cual se estudiaron los factores más importantes que limitaban dicho proceso en fase orgánica. En primer lugar se abordaron los problemas de la baja solubilidad de los compuestos Cx-DBT y su transporte desde la fase orgánica hasta la fase acuosa con la adición de surfactantes de distinta naturaleza (Tween 85, Tween 20, SDS, Tritón X-100) y codisolventes (etanol) , así como la optimización de su dosis. El efecto combinado de Tween 85 y etanol como codisolvente, permitieron obtener los mejores resultados de desulfuración. Posteriormente, se estudió el efecto de la adición de una segunda fuente de carbono en el medio de reacción, ya que se pensaba que esta podía ser incorporada al ciclo de Krebs y generar equivalentes reducidos, que posteriormente serían incorporados a la ruta 4S, de modo a reactivar el mecanismo enzimático, mejorándose así los rendimientos de biodesulfuración. Se realizaron distintos ensayos utilizando como sustratos, DBT, DBTO y DBTO2, en condiciones acuosas de resting cell añadiendo como fuentes de carbono, piruvato, citrato y succinato, obteniéndose los mejores resultados en con la adición de 5 g/L de piruvato. Por otro lado, se estudió la reutilización del microorganismo en el proceso de biodesulfuración de DBT, DBTO y DBTO2 en condiciones de resting cell en medio acuoso, sometiendo al microorganismo a tres ciclos de reacción. En dichos ensayos, se mantuvo la concentración de biomasa, la cual era recuperada entre ciclo y ciclo por centrifugación, y siendo resuspendida posteriormente en medio de reacción fresco. En estos ensayos se observó una pérdida de actividad desulfurante al aumentar el número de ciclos, la cual estaría provocada por las continuas etapas de centrifugación, sometiendo al microorganismo a un estrés. La reutilización no puede llevarse en condiciones bifásicas, debido a la elevada toxicidad de la fase orgánica. Finalmente, se realizó la caracterización del consumo y transporte de oxígeno del microorganismo en condiciones de resting cell en medio bifásico del proceso de biodesulfuración de DBT, el cual fue necesario realizarlo en tanque agitado de 2L, debido a que a que en esta escala es posible monitorizar la evolución de oxígeno con el correspondiente sensor. En este ensayo se determinó que los requerimientos de oxígeno necesarios para llevar a cabo los procesos de mantenimiento y biodesulfuración eran muy bajos, por lo que el oxígeno no iba a ser un factor limitante en el proceso de biodesulfuración. En cambio, si se observó una relación entre el suministro de caudal de aire y el rendimiento de biodesulfuración, obteniéndose los mejores rendimientos de desulfuración con un caudal de aire de 1L/L min.
- English
Sulfur dioxide emissions from fuel combustion are the mayor contributor to the acid rain and air pollution. For that reason governments are increasing their attention on the reduction of the limit of the sulphur content in oil fractions after refining. Actually, hydrodesulphurization is the most profitable process employ toremove sulphur from crude oil. This process is capable of reducing sulphur limits since 300-500 ppm of inicial concentration until next to 50 ppm. Nevertheless, regulations of UE and USA are demanding sulphur limits lowest than 10 ppm in diesel oil and gasoline on 2010. Conventional HDS process would need a high temperature and pressure conditions to remove recalcitrant molecules such as dibenzothiphene (DBT) and its derivates (Cx-DBT).and it would be much more expensive. Biodesulphurization is defined as a biological process in which biocatalyst is employed to remove sulphur compounds from oil fractions. These compounds can be converted to a final sulphur free compound, without change fuel properties under mild pressure and temperature conditions, which permits the reduction of the energetic consumption and operative costs. Currently, it seems that the most profitable way to desulphurize oils is by combined processes, hydrotreating the oil fractions first, following by the biological process. By this option, the recalcitrant compounds could be selectively removed, and 10 ppm of final sulphur content could be achieved, according to law restricitions. In this work, the biodesulfurization process using the GMO Pseudomonas putida CECT5279 has been studied. This bacterium carries the genes dszABC from Rhodococcus erythropolis IGTS8, and the gene hpaC. from Escherichia Coli. Therefore, it is capable to remove DBT and Cx-DBT following a biochemical route similar to the 4S pathway, which was elucidated for the wild strain R. erythropolis. This work approaches some problems relevant for the industrial application of the biodesulphurization process. The production of the biocatalyst using different bioreactor configurations, as well as, the scale up of the growing process has been carried out. In the same way, kinetics study of resting cell reactions has been conducted for the degradation of DBT and Cx-DBT, using orbital shaker and stirred tank reactor as working scales, both in aqueous and biphasic conditions. On the other hand, different studies to optimize the biodesulphurization process have been done. These include the improvement of Cx-DBT transfer between aqueous and oil phases, reuse of biocatalyst and characterization and enhancement of the aeration conditions. All of these operational conditions and modification of the reaction media composition for biphasic reactions have been used for the experiments conducted at different working scales with the model oils assayed, as well as or the treatment of a real hydrotreated diesel sample. On the chapter of the biocatalyst production and scale up of the growing process, a comparative study of the kinetics of the growth has been carried out for two different bioreactor configurations (air-lift and stirred tank reactors), based on the protocol proposed by Martin y col., 2004. For the biomass production using air-lift reactor, it has been studied the aeration conditions to maximize the growth and the evolution of the desulfurization capability with the growing time. Simultaneously, it has been characterized the oxygen mass transfer conditions, and the consumption of oxygen for the biocatalyst along the production process. On the other hand, due to the high amount of biocatalyst required for biodesulphurization experiments performed in stirred tank reactor, it has been done a scale up of biomass production process until 15L stirred tank bioreactor. This scale up process has been based on the maintenance of the aeration conditions and it has permitted to get enough biocatalyst without losing desulphurization capability. On the next chapter, it has been studied the kinetics of degradation of DBT and Cx-DBT: 4-metyl-DBT, 4,6-dimetyl-DBT and 4,6dietyl-DBT, individually and mixed. These model compounds are the most abundant in the last oil fraction before hydrodesulphurization process. It has been obtained the kinetic parameters that describe the degradation of the Cx-DBT compounds, in aqueous and biphasic reaction media. The effect on the biodesulphurization yield of the presence of several mixtures of sulphur compounds and the cellular age employed for the treatment of them was evaluated as well. This work includes the characterization and biodesulphurization of a real hydrotreated diesel sample from REPSOL YPF. Using HPLC-DAD, it was identified the more abundant aromatic sulphur compounds. The biodesulphurization o this sample was conducted into a 2L stirred tank reactor using the operational conditions established for the model oil. In the last chapter it has been presented different issues to improve the resting cell biodesulphurization process. It is recognized that the problem of DBT transfer between liquids layer could be the limiting step of the biodesulphurization process. For that reason, it has been studied the influence of the addition of several surfactants (Tween 85, Tween 20, SDS and Triton X-100) and ethanol as co-solvent. With the aim to enhance the sulphur compound bioavailability, stabilizing the emulsion and reducing the mass transfer problems. It has been established the best surfactant, and the dosage to be used to increase the biodesulphurization yield. In relation to these assays for the enhancement o biodesulphurization process, it was study the possibility of the reducing equivalent regeneration by the addition of several carbon sources into the resting cell reaction media. The evaluation of the use of pyruvate, succinate and citrate for the degradation of DBT and two of their metabolites according to the 4S pathway was assayed in aqueous and biphasic conditions and orbital shaker. Another factor that it has been studied was the reuse of the biocatalist. It was investigated the possibility of three cycles of biodesulfurization using DBT and two intermediates of the 4S route as substrates, in aqueous phase. As well as, it was evaluated the effect of the addition of pyruvate in the reuse of the biocatalyst. Once it was established the optimal operational conditions for the biodesulfurization process in orbital shaker, these were used in stirred tank bioreactor to determinate the oxygen consumption both for the cellular maintenance and for the biodesulfurization process of DBT in biphasic reaction media. In the same way, it was evaluated the effect of the air supply on the DBT biodesulphurization yield.
- español
