Resumen de Estrategias para el desarrollo de un nuevo producto cárnico fermentado de cerdo ibérico con compuestos nitrogenados bioactivos mediante la inoculación de microorganismos seleccionados y la enzima EPg222
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Introducción Las proteínas son un componente de los alimentos que tradicionalmente se ha catalogado de elevado valor biológico por su composición de aminoácidos y digestibilidad. Recientemente, se han propuesto nuevos parámetros para indicar que una proteína es funcional, como son el grado de degradación de la misma o el potencial de un alimento para proporcionar compuestos nitrogenados biológicamente activos. Varios estudios atribuyen a los compuestos bioactivos un papel beneficioso para la salud humana: antihipertensivos, antitrombóticos, antioxidantes, immunomoduladores, antimicrobianos, prebióticos, hipocolesterolémicos. Estos compuestos pueden estar presentes bien en las materias primas, o pueden ser generados durante el procesado de los alimentos por enzimas microbianas, o bien durante la digestión de las proteínas por las enzimas digestivas. Generalmente se trata de compuestos nitrogenados de bajo peso molecular (<5 kDa) y cuya actividad está asociada a su secuencia y composición de aminoácidos. El potencial de la leche para liberar péptidos biológicamente activos ha sido ampliamente estudiado (Clare y Swaisgood, 2000), así como la capacidad que los enzimas de las bacterias ácido lácticas (BAL) tienen para generar compeustos bioactivos en los productos lácteos. Sin embargo, poco se conoce sobre el papel de la carne y los productos cárnicos para generar este tipo de compuestos (Arihara, 2006). Durante el procesado de los productos cárnicos curados, las BAL y micrococaceas o estafilococaceas juegan un papel muy importante en las fenómenos proteolíticos de la carne generando péptidos y aminoácidos que participan en las características sensoriales de estos productos. Además, numerosos estudios describen como es posible generar péptidos bioactivos a partir de la carne, ya sea mediante su digestión con las enzimas endógenas o bien inoculando en la carne enzimas exógenas (Nakashima y col., 2002; Saiga y col., 2003a, b; Katayama y col., 2004; Jang y Lee, 2005, Vercruysse y col., 2005). Por otro lado, la utilización de una proteasa extraída del moho Penicillium chrysogenum aislado de jamón curado, EPg222 (actualmente patentada por la Universidad de Extremadura), ha mostrado elevada actividad proteolítica sobre proteínas miofibrilares “in vitro” y en ensayos sobre carne y embutidos crudos-madurados (Benito y col, 2002; 2003a; 2003b, 2004; 2005), generando pequeños péptidos y aminoácidos a partir de las proteínas cárnicas cuya actividad aún no ha sido estudiada.
En este contexto surge este proyecto, puesto que sería muy interesante estudiar el papel que BAL, estafilococaceas o micrococaceas, y la proteasa EPg222, adecuadamente adaptados al procesado de los embutidos crudos curados de cerdo ibérico de la región de Extremadura, pueden desarrollar en la generación de compuestos bioactivos durante el procesado de los productos cárnicos fermentados y así poder obtener nuevos productos de cerdo ibérico funcionales comerciales.
Desarrollo teórico En este trabajo se han utilizado, de entre las cepas de BAL, micrococaceas y estafilococaceas autóctonas de embutidos de cerdo ibérico de diferentes industrias de Extremadura, dos cepas de Pediococcus acidilactici (MS198 y MS200) y una de Staphylococcus vitulus (RS34), que fueron las que mostraron mejores características acorde con los criterios tecnológicos y de seguridad para ser usadas como cultivos iniciadores mixtos en la elaboración de embutidos de cerdo Ibérico de procesado tradicional (Casquete, 2011). Así, dos cultivos iniciadores mixtos (P198S34 y P200S34) formados por la combinación de una cepa de P. acidilactici y la cepa de S. vitulus se inocularon en dos productos diferentes (chorizo y salchichón) elaborados en la industria 1, donde los embutidos sufría un proceso de maduración más corto. El cultivo iniciador P200S34 y la proteasa EPg222, obtenida por sobreexpresión de P. chrysogenum, se utilizaron en también, juntos y por separado, para elaborar salchichones en la industria 2, con un procesado de maduración más largo.
El análisis de diferentes muestras tomadas a lo largo de la maduración de los embutidos, mostró que todos los cultivos iniciadores mixtos estudiados fueron capaces de implantarse y desarrollarse en los dos procesos de elaboración ensayados, sin modificar significativamente las características físico-químicas de los embutidos. Además el cultivo mixto P200S34, formado por la cepa de P. acidilactici MS200 y S. vitulus RS34 mostró una mejor adaptación a las condiciones del procesado de los salchichones de la industria 1.
Se estudió la actividad proteolítica de los distintos cultivos iniciadores y su capacidad para formar compuestos nitrogenados con actividades funcionales. Se extrajeron los compuestos nitrogenados menores de 5 kDa en diferentes días a lo largo del procesado con el método descrito por Bauchard y col., (2006). La actividad antihipertensora de dichos extractos se determinó midiendo la inhibición de la enzima conversora de la angiotensina-I de acuerdo con el método desarrollado por Sentandreu y Toldrá (2006a, b), con algunas modificaciones (Quirós y col., 2009). Para evaluar el potencial antioxidante se empleó la capacidad de absorción de oxígeno radical (ORAC) siguiendo el método desarrollado por Ou y col., (2001) y adaptado para un lector de fluorescencia de placas multipocillo por Dávalos y col., (2004). Se estudió la actividad antimicrobiana de los extractos frente a Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella cholerasuis, Staphylococcus aureus y Listeria monocytogenes con el Bioscreen C que permite la monitorización del crecimiento de microorganismos mediante turbidimetría (Ruiz-Moyano y col., 2009a, b). La actividad antiproliferativa sobre el crecimiento de células tumorales Caco-2 se evaluó con el método descrito por Olsen y col., (2012). Estas actividades se estudiaron antes y después de simular la digestión gastrointestinal (SDGI) in vitro según el método descrito por Cinq-Mars y col., (2008), con algunas modificaciones y se correlacionaron con los compuestos mayoritarios detectados por HPLC-ESI-MS en los extractos (Gómez-Ruiz y col., 2008).
Los resultados obtenidos mostraron que se producía una mayor concentración de compuestos nitrogenados en las muestras obtenidas de los chorizos, sin que aparecieran diferencias significativas entre los cultivos iniciadores utilizados y el lote control. En las muestras de salchichones, destacaron los lotes elaborados con la proteasa EPg222, sola o en combinación con el cultivo iniciador P200S34. Tras la SDGI, las concentraciones de los chorizos descendieron a la vez que aumentaba la de los salchichones, de modo que se igualaron las concentraciones de compuestos nitrogenados, sin que aparecieran diferencias significativas entre los distintos cultivos iniciadores utilizados.
El análisis de la actividad inhibidora de la enzima conversora de la angiotensina reveló una mayor actividad en los lotes elaborados con el cultivo iniciador P200S34 en la industria 1. Además, la inhibición producida fue similar a la que mostraron los lotes inoculados con la proteasa EPg222 al final de la maduración (90 días) en la industria 2. Sin embargo, el máximo de actividad se observó en estos dos últimos lotes a los 65 días de maduración de los salchichones en la industria 2. En cuanto a la actividad antioxidante presente en los extractos, volvieron a destacar el cultivo iniciador P200S34 en los salchichones elaborados en la industria 1, así como el lote que contenía la enzima EPg222, sola o en combinación con el cultivo iniciador P200S34. La actividad observada en los chorizos. La SDGI mantuvo o produjo un aumento de ambas actividades en todos los lotes elaborados, excepto en el lote de salchichones inoculado con el cultivo iniciador P200S34 en la industria 1 que disminuyó, lo cual hace pensar que los compuestos nitrogenados liberados por este cultivo iniciador durante los 65 días de maduración de los salchichones son más sensibles a la acción de las enzimas digestivas.
Se observó un claro efecto del tiempo de incubación de los extractos de compuestos nitrogenados con las células tumorales de colón, de modo que a mayor tiempo de incubación, mayor inhibición del crecimiento se produjo. Así, tras 72 horas de incubación se observaron los mayores porcentajes de inhibición por parte de los compuestos nitrogenados presentes en los extractos. A pesar de esto, apenas se observó inhibición por parte de los extractos obtenidos de los chorizos. Sin embargo, en los extractos obtenidos de los salchichones se observaron porcentajes de inhibición entre el 40% y el 60%, destacando los lotes inoculados frente a los lotes control. La SDGI aumentó significativamente la actividad presente en las muestras de chorizo mientras que en los salchichones, dicha actividad se mantuvo e incluso en algunos lotes disminuyó.
Por otro lado, la actividad antimicrobiana frente a bacterias patógenas no se observó en los extractos de los distintos lotes y embutidos hasta el final del proceso de maduración de los embutidos. No se detectó inhibición del crecimiento de Listeria monocytogenes, aunque si se produjo inhibición en el crecimiento de otros patógenos gram negativos como Escherichia coli y Salmonella choleraesuis, y gram positivos como Staphylococcus aureus y Bacillus cereus. Sobre este microorganismo se produjo la mayor inhibición observada. Los cultivos iniciadores que contienen el cultivo iniciador P200S34 y la proteasa EPg222 tuvieron los mayores efectos inhibitorios sobre el crecimiento de patógenos, haciendo de estos una herramienta prometedora para el control biológico en la industria cárnica. De nuevo, la SDGI aumentó el grado de actividad presente en los extractos.
Finalmente, se identificaron los componentes nitrogenados mayoritarios presentes en los extractos y se observó una clara relación entre estos y el tipo de producto y procesado utilizado, sin existir muchas diferencias en cuanto al cultivo iniciador inoculado.
Conclusión Las actividades fueron más altas en el lote con la enzima EPg222 y el cultivo iniciador P200S34, juntos y separados. Además, se mantuvieron estables tras la SDGI. La actividad inhibidora de la ECA se relacionó con compuestos nitrogenados denominados P4, P5 y P7. La actividad antioxidante se asoció con compuestos endógenos de la carne (carnosina, anserina) y otros provenientes de la proteólisis (lisina, metionina, tiramina). Las actividades antiproliferativa y antimicrobiana no se asociaron a ninguno de los compuestos mayoritarios.
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The purpose of this work was to investigate the influence of autochthonous starters cultures and the protease EPg222 on the generation of antihipertensive, antioxidant, antiproliferative and antimicrobial nitrogen compounds during the ripening of Iberian dry-fermented sausages. Starters P200S34 (P.acidilactici M200 and S.vitulus RS34) and P198S34 (P.acidilactici MS198 and S.vitulus RS34), and the purified protease EPg222, separately or in combination with the starter culture P200S34 were used to make Iberian dry-fermented sausages “salchichón” and “chorizo”. Nitrogen compounds smaller than 5 kDa were extracted on different days during the ripening process. Antihypertensive activity was determined measuring the inhibition of the angiotensin-I-converting enzyme. The oxygen radical absorbance capacity (ORAC) assay was employed to evaluate the antioxidant potential. It was tested antimicrobial activity against Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella cholerasuis, Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes, and the antiproliferative activity on growth of Caco-2 colon adenocarcinoma cell line. These activities were studied before and after simulated gastrointestinal digestion in vitro and correlated with the most relevant compounds detected by HPLC-ESI-MS in the final ripened extracts. The activities were highest in batches with the enzyme EPg222 and the starter culture P200S34, both together and separately. In adittion, these activities were stable after in vitro simulated gastrointestinal digestion. Antioxidant activity was associated with endogenous compounds of meat (carnosine, anserine) and others from proteolysis (lysine, methionine, tyramine). ACE inhibitory activity was related to nitrogen compounds called P4, P5 and P7. The antiproliferative and antimicrobial activities were not associated with any of the major compounds.
