Análisis funcional del autoantígeno CENP-A en la organización estructural del centrómero de mamíferos
- Autores: Francisco Javier Figueroa García
- Directores de la Tesis: Manuel J. Martinez Valdivia (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Cádiz ( España ) en 2002
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Jesús Ávila de Grado (presid.), Manuela Ortiz Santesteban (secret.), Alfredo Villasante Atienza (voc.), Marina Garcia Delgado (voc.), Juan Jiménez (voc.)
- Materias:
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- Resumen
El objetivo principal de este trabajo era profundizar en la función que desempeña el antígeno centromérico humano CENP-A, en el papel general del centrómero. Para ello se plantearon cinco objetivos puntuales a desarrollar:
1,- Generar anticuerpos monoespecíficos contra el antígeno centromérico humano CENP-A para su uso posterior en ensayos tanto in vivo como in vitro.
2,- Ensayos del papel de la proteína centromérica CENP-A durante distintas fases del ciclo celular mediante el análisis por microinyección celular de los anticuerpos específicos anti-CENP-A generados.
3,- Establecer un protocolo inicial de purificación del autoantígeno humano CENP-A a partir de células y/o tejidos humanos, para su empleo en ensayos funcionales.
4,- Realizar ensayos de inmunoprecipitación de cromatina a partir de extractos nucleares humanos y analizar los componentes (ácidos nucleicos y proteínas) centroméricos coinmunoprecipitados con CENP-A.
5,- Aislar, clonar y caracterizar el gen del autoantígeno CENP-A en el genoma de hámster, y comparar la homología con el de otras especies ya descritas.
Se ha generado un anticuerpo específico frente a un péptido de la región aminoterminal de la proteína humana CENP-A. Dicho anticuerpo ha sido purificado en una columna de afinidad y posteriormente utilizado en ensayos de microinyección en células humanas (HeLa), los cuales han revelado el papel esencial de CENP-A para la formación del cinetocoro y la división de la célula.
Posteriormente se ha establecido un protocolo de purificación de la proteína nativa a partir de extractos de placenta humana, mediante solubilización de cromatina, cromatografía de intercambio iónico y de afinidad.
Asimismo, se ha llevado a cabo la inmunoprecipitación de complejos de cromatina centromérica con el mismo anticuerpo generado anteriormente.
El análisis mediante secuenciación de los ADN inmunoprecipitados ha revelado que no presenta
