Terapìa intralesional con células madre mesenquimales alógenicas para la prevención de las secuelas motoras y sensoriales en el modelo animal pediátrico de traumatismo craneoencefálico grave

• Autores: Ignacio Mastro Martínez
• Directores de la Tesis: Ana Serrano González (dir. tes.), Juan Casado Flores (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2014
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Jesús Argente Oliver (presid.), L. Soriano Guillén (secret.), Pedro de la Oliva Senovilla (voc.), Manuel Ramírez Orellana (voc.), A. Carrillo Alvarez (voc.)
• Materias:
  • Ciencias médicas
    • Ciencias clínicas
      • Pediatría
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Biblos-e Archivo
• Resumen

  • Introducción El traumatismo craneoencefálico (TCE) en pediatría supone una de las primeras causas de mortalidad y morbilidad. Además de las medidas de sostén, no existe en la actualidad un tratamiento farmacológico eficaz para disminuir sus efectos. Por ello, es necesario investigar nuevas dianas terapéuticas que puedan limitar sus efectos, disminuyendo el daño cerebral traumático secundario, y permitiendo la regeneración funcional y estructural de las áreas da-ñadas. La plasticidad neuronal se ha descubierto como una diana terapéutica en esta patología y puede ser activada por diferentes estímulos, entre los que se incluyen la rehabilitación inten-siva, la administración de factores tróficos y la terapia celular. Esta última se podría convertir en una alternativa cada vez más real para el tratamiento del TCE, aunque es necesario la reali-zación de ensayos clínicos con modelos de experimentación animal que permitan validar su eficacia y determinar cuáles son sus mecanismos de actuación.

    Aunque inicialmente se pensaba que la célula ideal procedía del propio sujeto, se ha comprobado en modelos animales de terapia celular que el tratamiento con células alogénicas es igual de eficaz y seguro que la terapia autóloga. De esta manera es posible disponer de una gran cantidad de células mesenquimales para su administración en fase aguda sin tener el retraso que conlleva la extracción, purificación y ampliación de células autólogas en cultivos celulares.Otros grupos celulares, como son las originarias de estirpe embrionaria, neuronal o hematopoyéticas, siendo también eficaces, plantean problemas éticos y prácticos en el mo-mento de su obtención, procesamiento o cultivo. Las células madre mesenquimales (MSC) de origen en tejido adiposo sortean y limitan muchos de los conflictos referidos, sin que exista evidencia de pérdida de eficacia.Se han utilizado varias fuentes de administración, siendo la vía intraparenquimatosa (ip) la que ha demostrado una mayor cantidad final de células trasplantadas en la zona de la lesión. Se discute si su mecanismo principal de actuación es la sustitución de los tejidos daña-dos o, lo que parece más probable, si es una inmunomodulación local la responsable de los buenos resultados funcionales en esta patología.

    Hipótesis En modelos de experimentación animal de TCE la administración intra y perilesional de MSC procedentes de médula ósea ha demostrado mejorar la evolución funcional. Sin embargo, la administración ip de células procedentes de tejido adiposo podría tener también un efecto beneficioso a través de la integración funcional y disminución de la inflamación secundaria a un TCE producido mediante un modelo animal de trauma craneal controlado.

    Objetivos 1.- Investigar en un modelo experimental en ratas jóvenes sometidas a un TCE contro-lado el efecto de la administración de MSC en el lugar de la lesión sobre la función motora y sensitiva.

    2.- Analizar la supervivencia y diferenciación de las células madre mesenquimales tras-plantadas en el tejido cerebral lesional y perilesional.

    3.- Conocer los mecanismo de protección y regeneración funcional por los que las MSC administradas ip podrían producir una mejoría funcional.

    Material y métodos Se utilizaron ratas hembras Sprague-Dawley de 7 días de vida y peso aproximado de 150-200 gramos, distribuidas en tres grupos (10 ratas por grupo): 1.- Control simple; 2.- Con-trol ip; 3.- MSC ip. Los animales control simple fueron sometidos al TCE mediante un modelo de trauma controlado por caída de peso (distancia 20 cm, Peso 35 gr). Los animales control ip se sometieron al mismo trauma, y a las 24 horas de este se les administró 40 mcL de suero salino fisiológico ip en el área ipsilateral al trauma y perilesional. Los animales MSC-ip recibie-ron el mismo trauma que los anteriores grupos, y a las 24 horas se les administró una única dosis de MSC derivadas de tejido adiposo (2*105 MSC) en la zona perilesional mediante inyec-ciones de 5 mcL. Todos los animales se sacrificaron a los 21 días del traumatismo craneal.

    Las MSC se obtuvieron de otras ratas Sprague-Dawley adultas, mediante extracción del tejido adiposo retroperitoneal. Se cultivaron e identificaron sus características mediante citometría de flujo. Para facilitar su reconocimiento posterior, se marcaron mediante infección con lentivirus para que pudieran expresar la proteína verde fluorescente (GFP). Se realizaron estu-dios de diferenciación hacia estirpe adipogénica y osteogénica que mantienen su capacidad funcional y mantienen al mismo tiempo la expresión de GFP.

    En las ratas objeto de estudio de se analizaron la función motora y sensitiva mediante los test de Rogers, test de Rotarod y test de la cinta de Sticky modificado (MST) a las 48 horas, y a los 7, 14 y 21 días tras el TCE. Mediante citometría de flujo, tanto en las ratas control como las MSC ip, se analizó la presencia de una población que reuniera las características de MSC en el tejido cerebral, tanto a las 48 horas tras el TCE (24 tras el trasplante celular) como a los 21 días. Se examinaron además el tamaño de la lesión cerebral, las características histológicas de la lesión mediante hematoxilina y eosina, la población de células granulares y piramidales en el hipocampo, la presencia de MSC mediante tinción de vimentina e inmunohistoquímica frente a la GFP y la presencia de progenitores neuronales mediante tinción con nestina.

    Resultados Se extrajeron de manera efectiva células mesenquimales del tejido graso retroperito-neal. El análisis mediante citometría de flujo demostró doble positividad para los marcadores de superficie mesenquimales CD29 y CD90, siendo negativo para marcadores hematopoyéticos CD45. Las células obtenidas mostraban morfología de células mesenquimales, y mediante cul-tivo en medios de diferenciación se consiguió que expresaran marcadores de adipocito y con-drocito. La infección mediante un lentivirus permitía la expresión de GFP, sin alterar la expre-sión de marcadores de superficie, morfología ni capacidad de diferenciación.

    La administración ip de MSC en ratas tras un TCE controlado mejoró la puntuación en el test de Rotarod a los 7 días, 14 días y 21 días. En el test de Rogers, mejoró la puntuación en el grupo de tratamiento ip a los 7 y 14 días, desapareciendo la diferencia al finalizar el periodo de observación. No se encontró diferencia en la puntuación en el MST.

    Mediante citometría de flujo se evidenció una población celular con características de mesenquimal a las 48 horas del TCE, en la zona de la lesión y trasplante, pero no a los 21 días. Dicha población no tenía refringencia propia verde. Sin embargo, mediante histología se en-contró una población de células vimentina positiva y GFP positiva en la zona de la lesión a las 48 horas, que disminuyó de número a las tres semanas del TCE.

    La administración de MSC no disminuyó el área de la lesión. Produjo un incremento de células piramidales, células granulares y células nestina positiva en la región CA3 y en el giro dentado del hipocampo, respectivamente, a las 48 horas del TCE. Sin embargo, dicha respuesta a las tres semanas se mantuvo solo en las células granulares del giro dentado, desapareciendo las diferencias en el resto. No hubo diferencias en ningún momento en el número de células piramidales en la región CA1 del hipocampo o en las células nestina positivo de la zona subventricular.