Desarrollo de métodos para la detección de gluten en alimentos, a partir de repertorios de anticuerpos recombinantes derivados de la respuesta inmune celiaca.
- Autores: Eduardo Rafael Garcia Calvo
- Directores de la Tesis: Teresa García Lacarra (dir. tes.), Aina García García (dir. tes.), María del Rosario Martín de Santos (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad Complutense de Madrid ( España ) en 2024
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Pablo E. Hernández Cruza (presid.), Luis Miguel Cintas Izarra (secret.), Verónica Isabel Dodero Bedaña (voc.), M Ángeles Martín Cabrejas (voc.), Esther Carrera Puerta (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Veterinaria por la Universidad Complutense de Madrid
- Menciones:
- Internacional
- Calificación: Sobresaliente Cum Laude
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: Docta Complutense
- Resumen
El gluten es la fracción proteica encontrada en extractos etanólicos de granos de cereales como trigo, cebada, centeno, espelta y kamut. Su consumo por parte de individuos sensibles puede desencadenar respuestas patológicas, como alergias, enfermedades autoinmunes u otro tipo de intolerancias.
A pesar de las numerosas terapias farmacológicas desarrolladas para tratar estas patologías, ninguna ha superado a la adhesión estricta a una dieta sin gluten como la medida preventiva y terapéutica más efectiva. La detección de gluten en alimentos se realiza principalmente mediante técnicas inmunoenzimáticas. Sin embargo, la identificación y cuantificación precisa del gluten sigue siendo un gran desafío, dado que diversos estudios han revelado notables discrepancias en la cuantificación de gluten cuando se comparan los resultados obtenidos con los kits disponibles en el mercado. En consecuencia, para abordar estas limitaciones y para complementar los métodos existentes, sigue siendo necesaria la investigación y el desarrollo de métodos de detección de gluten en alimentos.
El objetivo principal de esta tesis doctoral es el desarrollo de nuevas metodologías analíticas para detectar la presencia de gluten en alimentos. Para ello, se generaron anticuerpos recombinantes a partir de repertorios obtenidos de pacientes con enfermedad celíaca, siendo seleccionados utilizando la tecnología de phage display.
La colaboración con el Hospital Universitario Fundación Jiménez Díaz de Madrid permitió seleccionar pacientes con sospecha de padecer celiaquía. Estas personas, tras firmar un consentimiento informado, donaron sangre de la que se obtuvieron linfocitos productores de anticuerpos específicos. A partir de estas muestras biológicas se amplificaron las secuencias codificantes para las cadenas ligeras y pesadas de los anticuerpos. Además, a partir de un dAb, de origen semisintético, desarrollado anteriormente por nuestro grupo de investigación, se generó un juego de cadenas pesadas de Fab. A partir de este material, se generaron dos repertorios de Fab recombinantes. Se construyó un primer repertorio inmune clásico, y el segundo repertorio, que se denominó semiinmune, se obtuvo mediante la combinación de cadenas ligeras inmunes con cadenas pesadas semisintéticas.
Cuatro de los anticuerpos seleccionados, denominados Fab-C, Fab-E, Fab-H y Fab8E-4, mostraron la mayor especificidad y afinidad frente al gluten y fueron producidos como moléculas solubles.
El Fab-C se destacó en diferentes ensayos con muestras de complejidad creciente, permitiendo el desarrollo de un ELISA indirecto con un límite de detección de 11 mg/kg de gluten en alimentos. También se implementó un ELISA sándwich indirecto con Fab8E-4 como anticuerpo de captura y Fab-C como anticuerpo de detección, logrando una detección de hasta 10 mg/kg de gluten y con mayor exactitud que el ELISA indirecto. Ambas pruebas fueron validadas mediante el análisis de muestras de alimentos comerciales.
La caracterización de los anticuerpos incluyó el uso de sistemas de predicción del plegamiento de proteínas basados en inteligencia artificial, revelando la interacción de los CDR de los Fabs, con epítopos en la región C-terminal de la gliadina, una característica novedosa en comparación con anticuerpos comerciales, que se unen a la región N-terminal.
Finalmente, utilizando técnicas de secuenciación masiva del ADN, se ha analizado la composición de los dos repertorios de Fab recombinantes generados en esta tesis doctoral. Los resultados han puesto de manifiesto que muchas características de la respuesta inmune celíaca se transfirieron al repertorio inmune y a los anticuerpos obtenidos del mismo, y que mediante la metodología de phage display se produjo una auténtica selección por afinidad de los mejores anticuerpos frente a la gliadina.
