Purificacion y caracterizacion cinetica de oxidasas de aerococcus viridans implicadas en el metabolismo del glicerol
- Autores: Ariel Streitenberger Sergio
- Directores de la Tesis: Francisco García Carmona (dir. tes.), Álvaro Sánchez Ferrer (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Murcia ( España ) en 2001
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: José María López Roca (presid.), Fernando Soler Pardo (secret.), Estenio Sansinanea Aldo (voc.), Juana Mercedes Cabanes Cos (voc.), José Álvaro Cebrián Pérez (voc.)
- Materias:
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- Resumen
El crecimiento de un microorganismo como Aerococcus viridans con glicerol como única fuente de carbono, induce la síntesis de las enzimas glicerol fosfato oxidasa y lactato oxidasa. Cuando hay altos niveles de estas enzimas, el glicerol es rápidamente convertido a fosfato de dihidroxiacetona. Este último activa la ruta de síntesis de metilglioxal y genera fósforo inorgánico.
El objetivo general de este trabajo es purificar las enzimas lactato oxidasa y glicerol fosfato oxidasa para proceder posteriormente a su caracterización cinética y estudio. Para lo cual se optimizaron las condiciones de crecimiento de microorganismo para la máxima producción enzimática, se desarrollo un sistema de purificación para ambas enzimas y se realizo la coinmobilización de laenzima glicerol fosfato oxidasa y de Aerococcus viridans con catalasa para la producción de fosfato de dihidroxiacetona. La enzima lactato oxidasa fue purificada con una primera digestión con lisozima y Triton X-114, una posterior clarificación con CTAB, una precipitación con sulfato amónico y finalmente una columna de intercambio iónico. El grado de purificación obtenido fue de 32 veces, con una recuperación el 60% de la actividad enzimática y una actividad específica de 114.5 UE/mg proteina.La enzima purificada presento un aperente peso molecular de 48000 en condiciones disociantes en un gel de policacrilamida y el peso molecular de la enzima en su forma nativa, estimado por filtración en gel, de policacrilamida y el peso molecular de la enzima en su forma nativa, estimado por filtración en gel, fue de 187000 encontrándose en forma tetramérica. En cuanto a los inhibidores utilizados, se desarrollo un detallado estudio cinético de Cibacron Blue 3GA, que presento un tipo de inhibición dependiente del tiempo y pH. Luego de la obtención de la apoenzima de lactato oxidasa, esta se recuperó totalmente con la adición de FMN o FAD, observándose una afinidad 51 v
