Caracterización de genes de Rhizobium tropici CIAT 899 implicados en la biosíntesis de los factores de nodulación independiente de la activación por flavonoides e inducidos por estrés osmótico
- Autores: Pablo del Cerro Sánchez
- Directores de la Tesis: Francisco Javier Ollero Márquez (dir. tes.), Francisco Pérez Montaño (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Sevilla ( España ) en 2019
- Idioma: español
- Número de páginas: 330
- Tribunal Calificador de la Tesis: José María Vinardell González (presid.), Francisco Javier López Baena (secret.), Esther Menéndez (voc.), Jose Ignacio Jiménez Zurdo (voc.), María José Soto (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Biología Molecular, Biomedicina e Investigación Clínica por la Universidad de Sevilla
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: Idus
- Resumen
- español
En el establecimiento de la simbiosis rizobio-leguminosa, los flavonoides secretados por las raíces activan un regulador transcripcional (proteína NodD) que por unión a unas secuencias promotoras conservadas en los rizobios (nod-box) activan la transcripción de los genes conocidos como genes de nodulación (o genes nod). Estos genes codifican para unas proteínas que están implicadas en la biosíntesis y secreción de una molécula de naturaleza lipoquitooligosacarídica conocida como factor de nodulación (o factor Nod). Este factor inicia una cascada regulatoria en la leguminosa que culmina con la formación de unas estructuras conocidas como nódulos en las raíces donde el rizobio se establecerá y fijará nitrógeno atmosférico hasta una forma utilizable por la planta. Rhizobium tropici CIAT 899 es una estirpe de rizobio que, además de tolerar diferentes estreses abióticos, sintetiza factores Nod bajo estrés salino. Así, en la presente Tesis Doctoral se ha estudiado la regulación de la síntesis de factores Nod en condiciones estresantes y no estresantes, y su implicación en el establecimiento de la simbiosis con diferentes leguminosas como Phaseolus vulgaris, Leucaena leucocephala, Lotus japonicus y Lotus burttii.
Para ello, se llevaron a cabo estudios transcriptómicos donde se observó que los genes de nodulación de CIAT 899 se inducen tanto en presencia del flavonoide apigenina como en condiciones de estrés osmótico, ya sea estrés iónico salino o estrés no iónico en presencia de manitol. A continuación, se buscó qué genes están implicados en las vías de síntesis de factores Nod bajo estrés osmótico. Así, por mutagénesis dirigida se determinó que el regulador NodD2 y un regulador perteneciente a la familia AraC son esenciales en la activación de los genes de nodulación y en la síntesis de factores Nod bajo estrés osmótico. Por otro lado, también se identificó a un regulador transcripcional NrcR que, aunque promovió la activación de los genes nod en presencia de apigenina y estrés salino, también reprimió el número de decoraciones que presentaron los factores Nod, además de afectar a otros fenotipos como movilidad de superficie y producción de exopolisacáridos. También se estudió el papel de las tres copias del gen nodA presentes en el genoma de este rizobio. Así, por mutagénesis dirigida por deleción no polar se observó que NodA1 y NodA3 (este a pesar de que nodA3 carece de nod-box) son esenciales en la síntesis de factores Nod en presencia de apigenina y estrés salino, mientras que NodA2 por sí solo no es capaz de sintetizar estas moléculas en presencia de apigenina y solo lo hace ligeramente en presencia de estrés salino.
Por último, en cuanto a los fenotipos simbióticos de los mutantes obtenidos anteriormente, se observó que NodD1 es esencial para establecer simbiosis con L. leucocephala y L. japonicus, mientras que ambos NodD1 y NodD2 lo son en las otras dos leguminosas de estudio: P. vulgaris y L. burttii. Por otro lado, se observó que NodA1 o NodA3 por sí solos son suficientes para establecer simbiosis con todas las leguminosas ensayadas, mientras que NodA2 por sí solo no puede establecer simbiosis con L. leucocephala y L. japonicus.
Todos estos datos apuntan a que la activación de la síntesis de los factores Nod bajo estrés osmótico juega un papel en el establecimiento de la simbiosis con determinadas leguminosas. Futuros trabajos aportaran más datos acerca de este hecho.
- English
In the establishment of the rhizobia-legume symbiosis, the flavonoids secreted by the plant roots activate a transcriptional regulator (NodD protein) that activates the transcription of the nodulation genes (known as nod genes) by binding to the rhizobia-conserved promoter sequences (nod-boxes). The nod genes encode for proteins that are involved in the biosynthesis and secretion of the Nodulation factors (also known as Nod factors). These Nod factors start a regulatory pathway in the legume that culminates in the formation of structures on the roots called nodules, where the established rhizobia will fix atmospheric nitrogen into a reduced form appropriate for the plant metabolism. Rhizobium tropici CIAT 899 is a rhizobial strain which tolerates different abiotic stresses and it is able to synthesizes Nod factors under salt stress. Due to this fact, in this Thesis it has been studied the regulation of the synthesis of Nod factors under stressful and non-stressful conditions, and their involvement in the establishment of the symbiosis with different legumes including Phaseolus vulgaris, Leucaena leucocephala, Lotus japonicus and Lotus burttii.
To achieve this goal, ARNseq studies were carried out. Here, it was observed that the CIAT 899 nod genes are induced both in the presence flavonoid apigenin and under osmotic stress, either salt stress or non-ionic stress produced by mannitol. Then, it has been studied which genes are involved in the activation of the Nod factor synthesis pathway under osmotic stress. Thus, directed mutagenesis determined that NodD2 and a new regulator belonging to the AraC family are essentials in the activation of the nod genes and therefore in the synthesis of Nod factors under osmotic stress. On the other hand, a new transcriptional regulator NrcR was also identified. This protein promoted the activation of the nod genes in the presence of apigenin and salt stress but at the same time, it repressed the number of decorations of the Nod factors. Moreover, NrcR regulates other phenotypes such as surface motility and exopolysaccharides production. In addition, it has been also studied the role of the three copies of the nodA gene which are located in the genome of CIAT 899.
Thus, non-polar deletion mutagenesis demonstrated that NodA1 and NodA3 (nodA3 gene lacks nod-box upstream) were both required for the synthesis of Nod factors in the presence of apigenin and salt stress, while NodA2 is not able to synthesize these molecules in the presence of apigenin but it does slightly under salt stress.
Finally, the symbiotic phenotypes of the mutants obtained before were studied. Here, it was observed that NodD1 is essential to establish symbiosis with L. leucocephala and L. japonicus, while both NodD1 and NodD2 are necessary for the establishment of the symbiosis in the other two legumes of this study: P. vulgaris and L. burttii. In addition, the presence of NodA1 or NodA3 is sufficient to establish symbiosis with all the legumes tested, while NodA2 by itself does not nodulate L. leucocephala and L. japonicus.
All these data indicate that the activation of the synthesis of the Nod factors under osmotic stress plays a role in the establishment of the symbiosis with certain legumes. Future jobs will provide more information about this fact.
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