Resumen de Presencia de listeria monocytogenes en productos cárnicos listos para el consumo (lpc) y en el ambiente de producción de industrias alimentarias
Listeria monocytogenes es el agente causal de la infección denominada listeriosis. Se asocian varias manifestaciones clínicas a la listeriosis que se pueden agrupar en dos categorías: listeriosis invasiva y listeriosis no invasiva. Los casos más graves de la forma invasiva pueden cursar con septicemia y/o meningoencefalitis en la población de riesgo, mientras que la listeriosis no invasiva puede desarrollarse en individuos sanos después del consumo de un número elevado de bacterias (>103 L. monocytogenes/g). La incidencia de la listeriosis es mayor en mujeres embarazadas, ancianos y personas inmunodeprimidas. La listeriosis se caracteriza por una alta mortalidad, entre el 10 y 30% (17% en la Unión Europea en 2010), aunque el número de casos (1.601) es menor que los producidos por la salmonelosis y campylobacteriosis.
Es un hecho demostrado que L. monocytogenes es capaz de colonizar el entorno de producción de alimentos y contaminar los alimentos causando la listeriosis. La contaminación en los alimentos está regulada por el Reglamento (CE) nº 2073/2005 relativo a los criterios microbiológicos para los productos alimenticios. Este Reglamento establece el límite de contaminación con L. monocytogenes por encima del cual un producto listo para el consumo (LPC) debe ser considerado inaceptable.
Uno de los objetivos del presente trabajo consiste en poner a punto y optimizar un procedimiento de muestreo superficial que podría ser utilizado en la vigilancia y control ambiental de Listeria en las industrias cárnicas. Otro propósito es determinar la prevalencia de L. monocytogenes en productos cárnicos LPC y en su entorno de producción, así como comparar una metodología rápida de PCR a tiempo real para la detección de L. monocytogenes con una técnica microbiológica convencional. Por último, se ha estudiado la susceptibilidad antimicrobiana de las cepas de Listeria aisladas a partir de los alimentos LPC y de las superficies ambientales.
En el primer objetivo, sobre una mesa de acero inoxidable, que tenía 10 años de uso en la restauración, se contaminaron cuadrículas de 100 cm2 con aproximadamente 105 ufc de dos cepas de L. monocytogenes, una de origen humano (CECT 935, ATCC 13932; serovariedad 4b) y otra aislada de un producto cárnico (437/07; serovariedad 1/2b). Cada cepa se recuperó (cinco réplicas) de esta superficie ensayando 9 procedimientos de toma de muestras ambientales. Estos métodos incluyen la esponja de celulosa, toalla pre-humedecida, hisopos (de algodón, de alginato y metálico), disco de algodón, gasa de algodón, 5 modelos de mini-rodillos (microfibra MR1, 100% fibra de lana MR2, 100% fibra de poliamida MR3, espuma de alta densidad MR4 y espuma flocada de alta densidad MR5) homogeneizado en Stomacher (letra S) y Vibromatic (letra V), bolitas de estropajo de acero inoxidable, placas RODAC (con agar PALCAM y agar ALOA) y sistema Petrifilm. Los recuentos se realizaron en los agares selectivos PALCAM y ALOA. Los resultados se han expresado como la media del porcentaje de recuperación ± desviación estándar de los recuentos obtenidos en las cinco repeticiones, calculados como el número de células de L. monocytogenes recuperadas en el muestreo (ufc/100 cm2) multiplicado por 100 y dividido por la cantidad inicial de L. monocytogenes con la que se contaminó la superficie (ufc/100 cm2).
La cepa de L. monocytogenes CECT 935 de origen humano (serovariedad 4b) obtuvo el mayor porcentaje de recuperación (más del 3%) en el muestreo con los mini-rodillos MR2S (6,51%), MR2V (4,61%), MR3S (3,65%) y MR3V (3,44%), mientras que las recuperaciones más bajas (menos de 0,30%) se obtuvieron con la toalla, hisopo de alginato, hisopo metálico y Petrifilm. En la recuperación de la cepa de L. monocytogenes 437/07 de origen alimentario (serovariedad 1/2b), los procedimientos de las placas de RODAC ALOA (4,15%) y RODAC PALCAM (4,11%) fueron los más eficaces, seguidos por el MR2V (1,36%), MR3S (1,24%), MR1S (1,21%) y MR2S (1,20%). Una vez más, los procedimientos que mostraron los porcentajes de recuperación más bajos para esta cepa fueron la toalla y los tres tipos de hisopos.
Tras el análisis estadístico de los datos, los cuatro modelos de mini-rodillos más eficaces (MR2S, MR2V, MR3S y MR1S) y la esponja de celulosa fueron seleccionados para un estudio adicional con diez cepas de L. monocytogenes aisladas de productos cárnicos contaminando superficies de acero inoxidable (mesa). Los resultados mostraron que los procedimientos más eficaces fueron el MR2S (4,15%) y MR2V (3,66%). Además, se estudió la recuperación de las doce cepas de L. monocytogenes citadas en una superficie de polietileno de alto peso molecular (tabla de corte), en la que el mejor procedimiento fue la esponja (2,90%), seguida por el MR2S (1,57%). Por último, el mini-rodillo 100% fibra de lana homogeneizado en Stomacher (MR2S) se comparó con la esponja de celulosa (comúnmente utilizado en la industria alimentaria) en la recuperación de las mismas doce cepas de L. monocytogenes en una lámina de acero inoxidable con la superficie intacta, revelando un mayor porcentaje de recuperación con el mini-rodillo MR2S (2,44%) que con la esponja (1,57%).
El siguiente paso en la investigación consistió en aplicar las mejores técnicas de toma de muestras obtenidas en el laboratorio a una serie de superficies en contacto directo o no con los alimentos en varias industrias cárnicas españolas. Para ello, se comparó la eficiencia del mini-rodillo 100% fibra de lana y la esponja de celulosa en el muestreo de superficies de acero inoxidable y polietileno de alto peso molecular, cintas transportadoras, equipos y herramientas utilizadas en industrias cárnicas ubicadas en las provincias de Zaragoza (5), Teruel (7), Salamanca (6), Cáceres (4), Badajoz (5) y Huelva (5), las cuales desempeñan un papel importante en el sector cárnico español. Sesenta y una superficies de 100 cm2 adyacentes se muestrearon con el mini-rodillo y la esponja de celulosa utilizando dos medios de enriquecimiento (caldo Fraser y ONE-Listeria selectivo para Listeria spp.). Se realizó, como análisis de rutina, en cada muestra recuento de L. monocytogenes e investigación de Listeria spp., recuento de aerobios mesófilos, recuento de Enterobacteriaceae e investigación de Escherichia coli. Además, se muestrearon 117 superficies con esponja de celulosa o con mini-rodillo sin plantilla de 100 cm2.
Se analizaron un total de 178 muestras de superficies del ambiente de producción de alimentos en las industrias cárnicas visitadas (39 de Zaragoza, 51 de Teruel, 25 de Salamanca, 22 de Cáceres, 18 de Badajoz y 23 de Huelva). En general, el 24,3% de las muestras de superficies fueron positivas a la presencia de L. monocytogenes, siendo similar el rendimiento en la recuperación de la esponja y el mini-rodillo MR2S. Se detectó L. monocytogenes con mayor frecuencia en superficies de acero inoxidable y cintas transportadoras. Solamente se obtuvo recuento de L. monocytogenes en dos superficies de acero inoxidable y que fueron de 4,9x10 y 1,0 ufc/cm2, respectivamente. Los recuentos medios de aerobios mesófilos obtenidos con la esponja (3,76 log ufc/cm2) fueron muy similares a los obtenidos con el mini-rodillo (3,71 log ufc/cm2), no mostrando diferencias significativas. Se detectó Enterobacteriaceae en el 13,0% de las muestras analizadas mostrando recuentos entre 1,0 a 5,0x102 ufc/cm2 y la presencia de E. coli fue confirmada en cuatro muestras diferentes, sin observarse diferencias entre los procedimientos de muestreo.
Al mismo tiempo que el muestreo ambiental, se analizaron 87 muestras de productos cárnicos LPC a partir de las industrias (productos cocidos (15), crudos curados (48), madurados con estructura muscular íntegra (23) y productos adobados (1)). También, se adquirieron de establecimientos de las ciudades de Huesca y Zaragoza, 20 productos cocidos, 8 crudos curados y 14 madurados con estructura muscular íntegra, alcanzando la cifra total de 129 productos cárnicos. Se realizó recuento de L. monocytogenes/g e investigación de Listeria spp./25 g en cada muestra de alimento el día de la compra y a mitad y al final del periodo de duración mínima almacenadas a 4°C y 10°C. Tres muestras (8,6%) de producto cocido analizadas el día de la compra presentaron recuentos de L. monocytogenes, siendo elevados en dos de las tres muestras (8,2x102 y 2,1x102 ufc/g). Esta tendencia fue constante durante todo el periodo de duración mínima en las muestras almacenadas a 4°C, aunque con recuentos más bajos. En los productos crudos curados, el 19,6% de las muestras presentaron recuentos entre 1,0x10 ufc/g y 9,1x102 ufc/g el día de la compra, disminuyendo drásticamente a lo largo de su período de duración mínima. Sólo dos muestras (5,4%) de productos madurados con estructura muscular íntegra presentaron recuento de 1,0x10 ufc/g el día de la compra. En general, el 7,8% de las muestras de productos cárnicos analizados el día de la compra mostraron recuentos que eran inferiores a 100 ufc/g, mientras que el 4,7% de las muestras excedido este límite.
L. monocytogenes/25 g se detectó en el 17,1% de los productos cocidos analizados el día de la compra, y este resultado se mantuvo constante durante todo el período de duración mínima en las muestras almacenadas a 4°C. Las muestras almacenadas a 10°C mostraron una tendencia decreciente en la positividad de L. monocytogenes durante todo el período de duración mínima. En los productos crudos curados, un alto porcentaje de las muestras (37,5%) fueron positivas el día de la compra, descendiendo el número a lo largo de su período de duración mínima. Por último, cabe destacar que el 24,3% de los productos madurados con estructura muscular íntegra han presentado la bacteria patógena el día de la compra, disminuyendo drásticamente la prevalencia a mitad y al final del periodo de duración mínima.
En general, la prevalencia de L. monocytogenes en los productos cocidos y en los crudos curados almacenados a 4°C ha sido mayor (2,6 veces superior) que a 10°C. Esto podría explicarse mediante la "teoría del agotamiento metabólico". Este fenómeno puede conducir a la "autoesterilizacion" del alimento y tiene lugar cuando el alimento, con características cercanas al umbral de crecimiento del microorganismo, se almacena a temperaturas relativamente altas (por ejemplo 10°C). En estas condiciones, los microorganismos pueden quedar subletalmente dañados y al tratar de reparar su mecanismo de homeostasis, comienzan a utilizar toda su energía y finalmente mueren por agotamiento metabólico.
Otro objetivo era reducir el tiempo necesario para determinar la presencia o ausencia de L. monocytogenes en muestras de alimentos. Doscientas muestras de productos cárnicos LPC enriquecidas en caldo Fraser y ciento cincuenta en caldo ONE-Listeria, se analizaron con PCR a tiempo real comparándolas con la microbiología tradicional. Estas muestras se obtuvieron en el muestreo de las industrias cárnicas de Salamanca, Cáceres, Badajoz y Huelva. Se analizaron utilizando el dispositivo LigthCycler 2.0, que utiliza Transferencia de Energía de Resonancia Fluorescente (FRET), y se amplificó el gen ssrA de L. monocytogenes con un control interno de amplificación (IAC). Este control interno es de tipo competitivo y se desarrolló amplificando el gen ALS1 de Candida albicans utilizando cebadores que contienen secuencias complementarias al gen ALS1 y al gen ssrA. Finalmente, el producto de PCR se une originando un plásmido vector, a continuación el plásmido fue clonado y el ADN extraído. Para la extracción del ADN de las muestras, se utilizó el kit de Qiagen Blood and Tissue (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. El termociclador tiene tres canales de detección que permiten la detección específica de los colorantes SYBR Green I (Canal 1), LightCycler RED-640 (canal 2) y LightCycler RED-705 (Canal 3). En este estudio se utilizaron los canales 2 (productos de PCR) y 3 (productos de control interno).
Los ensayos de PCR a tiempo real han mostrado que 148 muestras de productos cárnicos LPC enriquecidas en caldo Fraser de las 200 muestras analizadas fueron negativas con ambas metodologías, microbiología convencional y PCR a tiempo real. Las desviaciones negativa y positiva fueron de 27 y 6 muestras, respectivamente. De las 150 muestras de productos cárnicos LPC enriquecidas en caldo ONE-Listeria, 13 resultaron positivas a L. monocytogenes con ambos métodos. Además, 127 de las 150 muestras dieron resultado negativos a la L. monocytogenes utilizando ambos métodos. Diez muestras fueron positivas a L. monocytogenes utilizando el método alternativo (PCR a tiempo real), pero negativas con el método de referencia Listeria Precis. No se observó desviación negativa en esta comparación. Si se comparan los resultados obtenidos con la microbiología convencional en muestras enriquecidas en caldo Fraser y los obtenidos con PCR a tiempo real en muestras enriquecidas en caldo ONE-Listeria, el número de muestras positivas a L. monocytogenes es el mismo con ambas metodologías (23 muestras) pero 11 muestras mostraron desviación positiva y negativa.
La listeriosis transmitida por los alimentos es una enfermedad relativamente rara pero grave, con altas tasas de mortalidad (10-30%), especialmente para determinados grupos de riesgo de la población. Por lo tanto, es muy importante determinar la aparición de resistencias a antibióticos en cepas de L. monocytogenes. Se ha estudiado la susceptibilidad antimicrobiana de 286 cepas de Listeria aisladas de productos cárnicos LPC y del ambiente de producción de alimentos de las industrias cárnicas. Ciento ochenta cepas eran de L. monocytogenes (108 aisladas de productos cárnicos y 72 del entorno de producción) y 106 eran de L. innocua (75 aisladas de productos cárnicos y 31 de ambiente). Se han utilizado dos metodologías, una cualitativa (método de difusión en disco) y otra semicuantitativa (método Epsilon-test). La primera se ha utilizado para determinar la actividad in vitro frente a Listeria spp. de ampicilina, ciprofloxacino, clindamicina, claritromicina, amoxicilina-ácido clavulánico, cloranfenicol, eritromicina, estreptomicina, gentamicina, imipenem, levofloxacino, linezolid, meropenem, minociclina, moxifloxacino, oxacilina, penicilina G, rifampicina, sulfametoxazol, trimetoprim-sulfametoxazol, teicoplanina, tetraciclina, tigeciclina, trimetoprim y vancomicina. El método semicuantitativo se ha utilizado en los casos de indecisión en los resultados de sensibilidad o resistencia a los antibióticos frente al ciprofloxacino, clindamicina, linezolid, meropenem, penicilina G y tetraciclina.
Los resultados indicaron que L. monocytogenes presenta alta sensibilidad frente a 13 antibióticos de los 20 estudiados, al igual que L. innocua, la cual sólo se diferenció en el cloranfenicol (resistente) y la tetraciclina (sensible). Además, L. innocua fue muy sensible a la estreptomicina, eritromicina, minociclina, sulfametoxazol y trimetoprim. Todas las cepas de Listeria spp. fueron resistentes a oxacilina y alrededor del 37% a la clindamicina. Es importante remarcar que una cepa de L. monocytogenes presentó resistencia frente a tetraciclina.
