Nuevos métodos analíticos para la determinación selectiva de pirazinas, ácidos y otros compuestos de interés aromático presentes en cantidades traza
- Autores: Elisa Gracia Moreno
- Directores de la Tesis: Ricardo López Gómez (dir. tes.), Vicente Ferreira González (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Zaragoza ( España ) en 2015
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Enriqueta Anticó Daró (presid.), Purificación Hernández Orte (secret.), Jan Petrá¿ek (voc.)
- Materias:
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- Resumen
INTRODUCCIÓN Esta tesis está dividida en dos secciones y cuatro anexos. El objetivo de la misma era estudiar varias familias de compuestos orgánicos volátiles de relevancia en el aroma del vino presentes en el mismo en concentraciones traza. Para ello se han desarrollado métodos de análisis basados en la extracción selectiva de los analitos durante la preparación de muestra y la posterior separación por cromatografía de gases (GC) y detección por espectrometría de masas (MS) en distintos modos.
La primera parte de la tesis está centrada en el estudio de potentes compuestos del aroma del vino como son las 3-alquil-2-metoxypirazinas (MPs), concretamente 3-isopropil-2-metoxypirazina (IPMP), 3-secbutil-2-metoxypirazina (SBMP) y 3-isobutil-2-metoxypirazina (IBMP).
La segunda parte de la tesis comprende la investigación de dos familias de ácidos grasos en vino, considerados potenciales precursores de ésteres etílicos de gran potencia aromática. La primera de ellas compuesta por los ácidos 2-, 3- y 4-metilpentanoicos y el ácido ciclohexancarboxílico. El segundo grupo de ácidos grasos estudiados, que contiene un grupo hidroxilo en su estructura, está formado por los ácidos 2-hidroxi-2-metilbutanoico (2OH2MB), 2-hidroxi-3-metilbutanoico (2OH3MB), 3-hidroxi-3-metilbutanoico (3OH3MB), 2-hidroxi-4-metilpentanoico (2OH4MP) y 3-hidroxibutanoico (3OHB).
SECCIÓN 1 Las MPs son compuestos ampliamente estudiados en el aroma de diversos alimentos [1], y en particular del vino, por sus bajos umbrales de detección [2-4]. Estos hacen que incluso concentraciones de pocos ng/L de MPs puedan ser percibidos como un defecto por el consumidor, provocando en éste el rechazo del producto. Esto ha llevado a que sean foco de atención de muchos investigadores por su relevancia en la calidad final del vino [5]. Las MPs son compuestos varietales característicos de algunas uvas cuyo nombre es inmediatamente asociado al carácter vegetal de sus caldos. Este es el caso de las variedades Cabernet Sauvignon, Cabernet Franc, Merlot y Sauvignon Blanc. Además de la variedad, aspectos viticulturales y geoclimáticos influyen en el contenido de MPs en las uvas. La insolación que reciben las uvas y por tanto el nivel de poda de las vides, así como la irrigación, el frío y la latitud, y el grado de madurez de las uvas determinan la concentración final de MPs en las uvas [5]. El tiempo de maceración o su ausencia también son críticos en el nivel de MPs en el vino producido, pues la mayor concentración de MPs se da en los hollejos.
El interés por estos compuestos ha llevado a desarrollar multitud de métodos analíticos para determinarlos, la mayoría de los cuales están basados en micro-extracción en fase sólida por su rapidez y sencillez [5]. Sin embargo, los bajos niveles de concentración (ng/L) y la complejidad de la matriz hacen necesario recurrir a métodos de mayor selectividad, bien en la preparación de muestra bien en la determinación posterior, para poder obtener resultados cuantitativos.
CAPÍTULO 1 Desarrollo de un método de análisis de 3-alquil-2-metoxipirazinas en vino basado en la extracción en fase sólida con sorbentes de modo mixto y posterior cromatografía de gas y espectrometría de masas.
(Lopez, R.; Gracia-Moreno, E.; Cacho, J.; Ferreira, V. [6]) Experimental Se analizan 25 mL de vino a los que se añade el estándar interno (3-isopropil-2-metoxipirazina, IPEP) para obtener una concentración de 30 ng/L. Se ajusta el pH a 2.0 y se hace pasar la muestra por cartuchos de 1 mL que contienen 60 mg de resinas Bond Elut Plexa PCX (Varian) que han sido previamente acondicionados con 2.5 mL de diclorometano (DCM), 2.5 mL metanol (MeOH) y 4 mL de agua milli-Q. Una vez cargada la muestra, se lavan las resinas con 1 mL de agua milli-Q con MeOH (30%) ajustada a pH 2.0 y se secan con una corriente de nitrógeno durante 10 minutos. Se hace un segundo lavado, esta vez con 0.5 mL de DCM. La elución se realiza con trietilamina (TEA) en DCM (10 g/L). Primero se añaden 600 microlitros sin recoger el eluato, pues actúa como una etapa de lavado adicional, y luego se añaden otros 200 microlitros, cuyo eluato sí es recogido en micro-viales de reacción (1 mL, Supelco). A este eluato se le añaden 10 microlitros de octafluoronaftaleno (OFN) como estándar interno de inyección. Se lava el extracto con 1 mL de agua milli-Q ajustada a pH 3.0 con ácido tartárico. Esta mezcla se agita durante 2 min y se centrifuga durante 5 min a 2500 revoluciones por minuto. La fase orgánica que contiene las MPs se recupera cuidadosamente con ayuda de una micro-jeringa y se transfiere a un micro-vial donde se guarda a -25 ºC hasta su análisis. Para el mismo se inyectan 8 microlitros del extracto en el sistema de GC-MS en splitless frío y se detectan en modo de selección de iones (SIM) para incrementar la sensibilidad del análisis Resultados Se ha desarrollado un método de análisis selectivo basado en el uso de extracción en fase sólida (SPE) con resinas de intercambio catiónico en modo mixto. Se han utilizado las propiedades básicas de las MPs para retenerlas de forma selectiva en su forma catiónica, acidificando para ello las muestras de vino (pH 2). Asimismo, se ha aprovechado esa misma propiedad para eluírlas de forma selectiva en su forma neutra, empleando para ello DCM con un 10 % de TEA.
En primer lugar se hizo una comparación de resinas de modo mixto de varios fabricantes que permitió seleccionar las más eficientes en base a su volumen de ruptura para estos analitos. También se realizó una comparación de estrategias de elución en busca de un alto nivel de selectividad y de un buen factor de concentración de los analitos en el extracto final. La selectividad del extracto junto con la inyección de un gran volumen de muestra (8 microlitros) en un sistema de GC-MS-SIM ha permitido obtener bajos límites de detección (entre 0.3 y 0.5 ng/L).
Con este método es posible analizar el contenido de las MPs más comunes en vino, incluso en aquellos que no se caracterizan por altos contenidos de las mismas, como se verá en el siguiente capítulo. La adaptación del método al análisis de uvas se presenta también en este capítulo, así como algunos problemas prácticos junto con su solución o propuestas de mejora.
Conclusiones Se ha desarrollado y validado un método selectivo de análisis de metoxipirazinas (MPs) en vino, basado en el uso de resinas de modo mixto que combinan la interacción hidrofóbica y el intercambio catiónico para aislar y concentrar los analitos en una sola etapa de aislamiento.
El método proporciona un rango lineal satisfactorio y suficiente sensibilidad para determinar la concentración de 3-alquil-2-metoxipirazinas en vino partiendo de un pequeño volumen de muestra.
Tanto el factor de pre-concentración como la selectividad del método de preparación de muestra permiten cuantificar las metoxipirazinas en vino en niveles de ng/L usando sistemas de separación y detección ampliamente extendidos como es GC-MS-SIM. Sin embargo, aún es necesario prestar atención a la presencia de potenciales interferencias que co-eluyan y posean iones de fragmentación coincidentes con aquellos que se usan en la cuantificación de los analitos.
Tanto el pH del vino como la composición de las resinas de modo mixto han resultado ser determinantes en la retención y elución de compuestos básicos en las comparaciones realizadas.
Es de extrema importancia prestar atención a la suciedad introducida en el sistema por las muestras para poder asegurar la calidad del análisis.
CAPÍTULO 2 Análisis de 3-alquil-2-metoxipirazinas en varios lotes de vinos y uvas Experimental El método desarrollado en el capítulo anterior se ha utilizado en tres estudios sobre el contenido de MP en vinos y uvas.
Resultados En el primero de ellos se estudió un lote de vinos blancos chilenos de la variedad Sauvignon Blanc conocida por su alto contenido en estos compuestos.
En el segundo estudio se analizó un amplio lote de vinos tintos españoles de diferentes localizaciones, vendimias y variedades de uva. Hasta la fecha es el estudio más amplio realizado para determinar el contenido de MPs en vinos españoles y ha confirmado la baja concentración de las mismas en estos vinos. El estudio estadístico de los datos de concentración junto con datos sensoriales ha permitido correlacionar la concentración de IBMP con el aroma a pimiento verde. Sorprendentemente, no se han encontrado correlaciones con los descriptores vegetal o verdura. Sin embargo, se han encontrado correlaciones significativas de signo negativo entre la concentración de MPs y los aromas frutales, que indican la existencia de una sutil contribución de estos compuestos a la baja calidad del vino, aun cuando no están en una concentración lo suficientemente grande como para ser causantes de defectos por sí mismos.
En el tercer estudio se analizaron cuatro variedades de uva procedentes de Zaragoza (Cariñena y Garnacha) y Francia (Gros Manseng y Fer Servadou), así como los vinos realizados a partir de las uvas Fer Servadou, que resultaron ser las únicas con un contenido apreciable de MPs. Este estudio se realizó a lo largo de tres años para controlar el efecto de diversas técnicas vitivinícolas en el contenido final de MPs en vino. La adición de nitrógeno foliar en el envero no fue significativa para los niveles de MPs encontrados en las uvas. Sin embargo, esta adición de nitrógeno sí redujo significativamente los niveles de MPs en los vinos finales. En cuanto a las distintas vinificaciones, se observa una tendencia a la obtención de mayores niveles de MPs durante la maceración carbónica, que aunque no es significativa va en la línea de los resultados obtenidos en el siguiente capítulo de la tesis. Por otro lado, la adición de chips no produjo ningún efecto mientras que el uso de pre-fermentación en caliente sí produjo descensos significativos en el contenido de MPs.
Conclusiones La variedad de uvas utilizada determina en gran medida el contenido final de MPs en el vino. Así, los vinos blancos chilenos producidos exclusivamente a partir de uvas Sauvignon Blanc son más ricos en MPs que vinos tintos españoles producidos a partir de una mezcla de variedades. Incluso algunos vinos tintos españoles monovarietales producidos a partir de variedades ricas en MPs como Cabernet Sauvignon o Merlot presentan menores concentraciones de MPs que los vinos blancos analizados. Las variedades Cariñena, Garnacha y Gros Manseng son pobres en MPs, mientras que la variedad Fer Servadou es más rica en MPs, aunque no tanto como la Cabernet Sauvignon.
Este es el estudio más amplio realizado hasta la fecha acerca de la presencia de MPs en vinos españoles. Este estudio ha confirmado la baja relevancia de las MPs en los vinos tintos españoles pues solo cinco de los vinos estudiados tienen niveles de IPMP por encima de su umbral de olfacción y ninguno supera el umbral de IBMP. Además, no existen diferencias entre los vinos producidos en las distintas regiones de España en cuanto al contenido de MPs. El bajo rango de concentraciones obtenidas dificulta la posibilidad de ver la influencia ejercida por el clima en la concentración de MPs.
Los valores de MPs por debajo del umbral de olfacción, como los encontrados en los vinos españoles, no afectan a la calidad global percibida de los vinos. Estos bajos niveles de MPs no pueden ligarse a un impacto negativo directo en el aroma como el de los defectos u off-flavours. Sin embargo, se ha demostrado que sí existe una relación negativa entre la concentración de IBMP y la percepción de la mayoría de los aromas frutales, lo que deja entrever la posibilidad de una influencia negativa indirecta de las MPs en la calidad del vino.
El nivel de MPs puede controlarse hasta cierto punto por medio de técnicas vitivinícolas. La adición foliar de nitrógeno así como un tratamiento pre-fermentativo en caliente disminuyen el contenido final de IBMP en vino, mientras que la maceración carbónica permite incrementar esa concentración. Este conocimiento puede ser utilizado por los enólogos para mejorar la percepción sensorial de los vinos.
CAPÍTULO 3 Aproximación multidimensional y comparación de dos modos de detección para el análisis de 3-alquil-2-metoxipirazinas en vino (Legrum, C; Gracia-Moreno, E; Lopez, R.; Potouridis, T.; Langen, J.; Slabizki, P.; Weiand, J.; Schmarr, H. G. [7]) Experimental Este capítulo corresponde al trabajo realizado en la estancia llevada a cabo en Alemania (2012), que consistió en la síntesis de análogos deuterados de las tres MPs estudiadas en esta tesis con el objetivo de utilizarlas como estándares internos, aprovechando la mayor similitud a los analitos frente a otros compuestos no deuterados de la misma familia de las MPs. La segunda parte de este capítulo consiste el desarrollo de un método de análisis basado en la preparación de muestra presentada en el capítulo 1 en conjunción con cromatografía de gas multidimensional (MDGC) para mejorar la resolución de las interferencias que afectan a estos analitos.
Resultados En este capítulo se presenta solamente un breve resumen de la síntesis, que es explicada de forma detallada en el anexo I. Además, se realizó una comparación de dos métodos de detección, con y sin re-fragmentación de los iones obtenidos (MDGC-MS/MS y MDGC-MS-SIM). Así se pudo probar la presencia de interferencias a pesar de la mayor resolución proporcionada por el uso de MDGC y cómo para el análisis de compuestos a nivel ultra-traza es necesario utilizar las técnicas más selectivas y específicas disponibles en cada momento para obtener resultados cuantitativos fiables.
Conclusiones Se ha obtenido un método de análisis de MPs basado en la extracción selectiva y enriquecimiento a través de resinas de intercambio catiónico en modo mixto, mejorado gracias al uso del análisis multidimensional (MDGC-MS) que ha permitido la cuantificación de MPs a nivel de trazas (ng/L).
La comparación de dos modos de detección (SIM-MS y MS/MS) ha revelado la presencia de interferencias que co-eluyen en algunos vinos y que pueden ser suprimidas gracias a la mayor selectividad del modo MS/MS.
El uso del método aquí desarrollado ha permitido analizar vinos alemanes producidos con la variedad Sauvignon Blanc, en los que las MPs se encuentran en bajos niveles de concentración. Si bien el uso de maceración carbónica y la adición de raspones permite incrementar los niveles de MPs en el vino producido. Estas opciones de vinificación son especialmente prometedoras con el nuevo híbrido Cabernet blanc, que parece poseer un potencial mayor respecto a la generación de MPs que la conocida variedad Sauvignon blanc. Sin embargo, los datos obtenidos en este estudio acerca de estas opciones de vinificación son limitados e insuficientes para valorar el verdadero potencial de las mismas a la hora de incrementar la concentración de MPs.
SECCIÓN 2 En el vino se encuentran presentes diversos ácidos grasos y sus ésteres, relacionados entre sí por la reacción reversible de esterificación/hidrólisis que puede ser química o catalizada por enzimas. La relevancia de estos compuestos en el estudio del vino también viene dada por su potencia aromática. Los ácidos grasos están asociados a aromas como el del queso o rancio que pueden contribuir a depreciar la calidad del aroma percibido si su concentración es grande [8, 9]. Por el contrario, los ésteres de ácidos grasos son responsables de aromas bien distintos, generalmente frutales y altamente apreciados por el consumidor [8]. Aunque cierta cantidad de estos compuestos puede encontrarse en las uvas, su producción se debe mayoritariamente a la acción de los microorganismos implicados en la producción del vino [10, 11], así como a los procesos de esterificación e hidrólisis durante el envejecimiento [12]. El tipo de microorganismo (levadura o bacteria) así como la propia cepa y los nutrientes presentes en el medio son determinantes en la producción tanto de ácidos grasos como de sus correspondientes ésteres [11, 13]. Son compuestos, por tanto, modulables por las decisiones enológicas.
En la última década se ha puesto de manifiesto la relevancia aromática de algunos ésteres etílicos presentes en el vino a nivel de trazas y que hasta ahora habían sido ignorados. Este es el caso de los ésteres etílicos de los ácidos grasos e hidroxiácidos grasos detallados al comienzo de este resumen y estudiados en esta sección de la tesis [14-19]. Si la información disponible sobre estos ésteres etílicos es todavía escasa, la información sobre sus correspondientes ácidos grasos es prácticamente inexistente.
CAPÍTULO 4 Desarrollo y validación de un método selectivo basado en extracción en fase sólida y cromatografía de gases unida a espectrometría de masas en modo de ionización química negativa para cuantificar ácidos metilpentanoicos y ciclohexanocarboxílico en vino (Gracia-Moreno, E.; Lopez, R.; Ferreira, V. [20]) Experimental La extracción de los analitos se realiza acondicionando cartuchos de 200 mg de resinas LichrolutTM EN (cartucho de 3 mL) con 4 mL DCM, 4 mL MeOH y 4 mL disolución hidroalcohólica (12 %) sobre los que se cargan 50 mL de vino a los que previamente se ha adicionado ácido 2-etilbutanoico (concentración final en la muestra 10 ¿g/L) como estándar interno. Las bebidas con un alto contenido alcohólico como el whisky y el brandy, se diluyen hasta un 12 % de etanol antes de analizarlas. La muestra se carga en los cartuchos con ayuda de un sistema de vacío y una vez cargada se lavan las resinas con 3 mL de disolución alcohólica (40 % MeOH) tamponada a pH 3 con H3PO4/NaH2PO4. La elución se realiza con 5 mL de disolución alcohólica (40 % MeOH) tamponada a pH 7 con (NaH2PO4/Na2HPO4). Al eluato recogido en un matraz de 10 mL se le añaden 2 mL de una disolución de ácido tartárico 0.625 M para romper el tampon y se enrasa con agua milli-Q (pH final 3.0). La solución resultante se carga en un segundo cartucho de 50 mg de LiChrolutTM EN (cartucho de 1 mL) previamente acondicionado con 1 mL DCM y 1 mL MeOH. Se secan las resinas a vacío y se eluyen con 0.5 mL DCM recogiendo el eluato en viales de vidrio de 2 mL.
La derivatización se realiza añadiendo al extracto 20 microlitros de bromuro de 2,3,4,5,6-pentafluorobencilo y 500 microlitros de NBu4Cl 0.1 M en disolución acuosa tamponada (pH 6.0). La reacción transcurre con agitación durante 30 minutos a temperatura ambiente y se para añadiendo HCl (37 %). La fase orgánica se lava con 1 mL de agua milli-Q acidificada (pH 1.0) y posteriormente se seca con Na2SO4. A continuación se purifica a través de un lecho de 200 mg de sílica-gel 60 (cartucho de 1 mL), lavando con 1.5 mL de hexano que no se recogen. La elución se realiza con 1 mL de hexano/40 % tolueno (v/v). Finalmente, 1 microlitro de este extracto purificado se inyecta y analiza en un sistema de GC-MS- NCI (SCAN).
Resultados Se ha desarrollado un método de análisis altamente selectivo para la determinación de los ácidos 2-, 3- y 4-metilpentanoicos así como del ácido ciclohexancarboxílico en vino y otras bebidas alcohólicas. Se han utilizado las propiedades ácido-base de los analitos para aislarlos reteniéndolos en su forma neutra en resinas de tipo hidrofóbico en una primera etapa de SPE y eluyéndolos de forma selectiva a pH 7 en su forma aniónica dejando en las resinas una parte importante de la matriz inicial. Tras la neutralización del eluato y una segunda etapa de SPE se realiza una reacción de derivatización con un agente derivatizante halogenado que favorece tanto la selectividad como la sensibilidad de la posterior detección. Una etapa de purificación en sílica-gel permite eliminar el exceso de reactivo y cambiar a un disolvente más favorable para la posterior detección.
La separación se realiza por GC-MS utilizando como modo de detección la ionización química negativa (NCI) basada en la captación de electrones por átomos electronegativos presentes en los analitos. Los cinco átomos de flúor presentes en los analitos derivatizados les confieren una alta afinidad por los electrones y por tanto un incremento de sensibilidad muy importante que permite analizarlos sin problemas a nivel de pocos ng/L. Además, la selectividad proporcionada por todas las etapas de preparación de muestra ha proporcionado cromatogramas libres de interferencias en la zona de los analitos favoreciendo su cuantificación. Asimismo ha proporcionado extractos muy limpios que permiten el procesado de un gran número de muestras con escasa necesidad de mantenimiento del sistema.
También se presentan en este capítulo experimentos infructuosos de detección por medio de MS/MS en ion-trap así como los problemas generados por la presencia de una interferencia que afecta al 4MePc y las soluciones encontradas. Los detalles adicionales de la SPE y de la optimización de la reacción de derivatización se han trasladado a los anexos II y III respectivamente.
Conclusiones Se ha desarrollado un método muy robusto y selectivo basado en la extracción en fase sólida y la derivatización, para el análisis de los ácidos 2-, 3- y 4-metilpentanoicos y del ciclohexancarboxílico en una matriz compleja como es el vino.
La eliminación de interferencias a lo largo de las distintas etapas del método de preparación de muestra junto con la ionización selectiva en modo de ionización química negativa, ha permitido obtener límites de detección de pocos ng/L, lo suficientemente bajos como para cuantificar los analitos en vino y otras bebidas alcohólicas.
La limpieza de los extractos permite procesar un gran número de muestras manteniendo los requisitos de limpieza del sistema al mínimo.
La disponibilidad de este método permitirá desarrollar otros estudios que indaguen en el origen de estos ácidos y en su capacidad como precursores de los correspondientes ésteres etílicos.
CAPÍTULO 5 Desarrollo y validación de un método selectivo para cuantificar hidroxiácidos en vino (Gracia-Moreno, E.; Lopez, R.; Ferreira, V. [21]) Experimental Cartuchos de 1 mL empaquetados a mano con 200 mg LiChrolutTM EN se acondicionan con 4 mL of DCM, 4 mL of MeOH y 4 mL de disolución hidroalcohólica (12 % etanol). Las bebidas con un alto contenido alcohólico como el whisky y el brandy, se diluyen hasta un 12 % de etanol antes de analizarlas. Los estándares internos 2OH3MPr (IS-1) y 2OH33diMB (IS-2) se añaden a 10 mL de muestra para obtener una concentración final de 3.4 mg/L y 2.7 mg/L respectivamente. La muestra se hace pasar por las resinas sin modificar su pH natural con la ayuda de un sistema de vacío. A continuación se secan las resinas a vacío y se eluyen con 1 mL de DCM con 2 % of TEA, recogiendo el eluato en viales de 2 mL.
La derivatización se realiza añadiendo al extracto 20 microlitros de bromuro de 2,3,4,5,6-pentafluorobencilo y 500 microlitros de NBu4Cl 0.1 M en disolución acuosa tamponada (pH 6.0). La reacción transcurre con agitación durante 30 minutos a temperatura ambiente y se para añadiendo HCl (37 %). La fase orgánica se lava con 1 mL de agua milli-Q acidificada (pH 1.0) y posteriormente se seca con Na2SO4. A continuación se purifica a través de un lecho de 200 mg de sílica-gel 60 (cartucho de 1 mL), lavando con 1.5 mL de hexano que no se recogen. La elución se realiza con 1 mL de hexano/60 % éter dietílico (v/v). Finalmente, 2 microlitros de este extracto purificado se inyecta en un sistema de GC-MS y se analiza en modo EI o NCI dependiendo del analito de interés.
Resultados Se ha adaptado el método desarrollado en el capítulo anterior para el análisis de ácidos grasos con un grupo hidroxilo en su estructura: 2-hidroxi-2-metilbutanoico (2OH2MeBc), 2-hidroxi-3-metilbutanoico (2OH3MeBc), 3-hidroxi-3-metilbutanoico (3OH3MeBc), 2-hidroxi-4-metilpentanoico (2OH4MePc) y 3-hidroxibutanoico (3OHBc). El proceso de derivatización es el mismo que se ha descrito en el capítulo 4, mientras que la purificación requiere disolventes más polares. La polaridad debida al grupo hidroxilo ha hecho necesario el uso de una combinación de disolventes de mayor fuerza eluyente para eluírlos de la sílica-gel. Por otro lado, el uso de estándares internos adecuados permite obtener resultados cuantitativos aun cuando la recuperación neta de analito se aleja del 100%. Se incluyen además algunos consejos prácticos. La detección en modo EI es válida para algunos de los analitos mientras que otros se ven afectados por falta de fragmentos característicos que proporcionen sensibilidad suficiente (3OHB y 3OH3MB), cuestión particularmente crítica en el caso de analitos que se encuentran en pequeña concentración como el 3OH3MB. Por ese motivo se ha estudiado la detección tanto en el modo EI como en NCI por su mejora de la selectividad y de la sensibilidad.
Conclusiones Se ha desarrollado un método específico para el análisis de cinco hidroxiácidos presentes en el vino y otras bebidas alcohólicas, como son los ácidos 2-hidroxi-2-metilbutanoico (2OH2MB), 3-hidroxi-3-metilbutanoico (3OH3MB), 2-hidroxi-3-metilbutanoico (2OH3MB), 2-hidroxi-4-metilbutanoico (2OH4MP) y 3-hidroxibutanoico (3OHB).
Límites de detección de pocos ¿g/L, amplios rangos lineales y una recuperación de señal cercana al 100 % permiten el análisis de estos cinco hidroxiácidos en una amplia gama de muestras.
La disponibilidad de este método permitirá desarrollar otros estudios que indaguen en el origen de estos hidroxiácidos y en su capacidad como precursores de los correspondientes hidroxi ésteres etílicos.
Es necesario prestar atención a la suciedad introducida en el sistema por las muestras para asegurar la calidad del análisis.
CAPÍTULO 6 Ácidos grasos de cadena corta e hidroxiácidos en vino y otras bebidas alcohólicas: análisis y estudio de su importancia.
Experimental Utilizando los métodos de análisis desarrollados en los capítulos 4 y 5 se ha analizado una amplia muestra de vinos españoles que incluyen tintos, rosados, blancos, mistelas y vinos especiales criados bajo velo de flor (Jeréz, Manzanilla y Oloroso). También se han analizado otras bebidas alcohólicas como whisky, brandy y cerveza.
Resultados Aquí se presentan los resultados del primer estudio de la presencia de ácidos metilpentanoicos y ciclohexancarboxílico en vino, así como el primer estudio específico sobre los mencionados hidroxiácidos (2OH2MeBc, 2OH3MeBc, 3OH3MeBc, 2OH4MePc y 3OHBc) en vino y otras bebidas alcohólicas. Las concentraciones de los ácidos grasos se encuentran en el rango de ng/L mientras que las de los hidroxiácidos están en niveles de microgramos/L.
Se han encontrado diferencias muy interesantes en función del tipo de vino; particularmente, concentraciones mucho mayores en los vinos criados bajo velo de flor. El estudio estadístico ha permitido arrojar algo de luz sobre el posible origen biológico de estos analitos. En el caso de los metilpentanoicos y algunos hidroxiácidos (2OH3MB, 2OH4MP y 3OHB) se ha propuesto un origen fermentativo. Por el contrario el ácido ciclohexancarboxílico y el 2OH2MB podrían tener un origen endógeno en las uvas. Con los datos disponibles en este momento no se puede descartar un origen dual para el 2OH3MB, que además podría tener una dependencia varietal pues no se ha encontrado en vinos realizados a partir de las variedades Garnacha, Cabernet Sauvignon, Merlot o Macabeo.
Conclusiones En esta tesis se ha realizado el primer estudio específico de la presencia de dos grupos de ácidos grasos, uno de ellos formado por los ácidos 2-, 3- y 4-metilpentanoicos y del ciclohexancarboxílico y el otro formado por los hidroxi ácidos 2OH2MB 3OH3MB, 2OH3MB, 2OH4MP y 3OHB.
Se han obtenido resultados muy interesantes relativos a la distribución de estos ácidos grasos en distintos tipos de vino y bebidas alcohólicas, con niveles particularmente altos de la mayoría de estos ácidos grasos en los vinos criados bajo velo de flor en el sur de España.
El estudio estadístico de las concentraciones obtenidas induce a pensar en diferentes orígenes para estos ácidos. Por ejemplo, se ha postulado que tanto los ácidos metilpentanoicos como los hidroxi ácidos 2OH3MB, 2OH4MP y 3OHB pueden tener un origen fermentativo; mientras que el ácido ciclohexancarboxílico y el hidroxi ácido 2OH2MB podrían tener un origen endógeno. Los datos también sugieren una dependencia varietal del 2OH3MB debido a que no se ha detectado en ninguno de los vinos producidos exclusivamente con Garnacha, Cabernet Sauvignon, Merlot o Macabeo.
Por otra parte, si la hipótesis de que estos ácidos e hidroxi ácidos son precursores de sus correspondientes ésteres etílicos es cierta, se abre la posibilidad de llegar a controlar su concentración como potencial reservorio de aromas frutales. La selección de levaduras con habilidad para producir grandes cantidades de estos ácidos e hidroxi ácidos podría permitir producir vinos con un potencial de aromas frutales capaz de compensar las pérdidas de estos aromas que se producen debido a la hidrólisis de otros ésteres etílicos y acetatos a lo largo del tiempo.
ANEXO IV Análisis de tioles polifuncionales Experimental Se estudiaron distintos tipos de vinificaciones en cuatro variedades de uva diferentes (tres tintas y una blanca) para ver su efecto en la concentración final de tioles.
Resultados En vinos tintos, la maceración corta aumenta significativamente los niveles de MF y MOH, mientras que la pre-fermentación en caliente también aumenta significativamente los niveles de MF pero disminuye los de MOH. La adición de chips (de roble tostados en tintos y de acacia en blancos) produce un gran aumento de FFT.
Conclusiones Se ha observado que algunas técnicas de vinificación como la adición de chips de diversas maderas o la pre-fermentación en caliente tienen un fuerte impacto en la concentración final de tioles en el vino y que por tanto podrían ser utilizadas selectivamente por los enólogos para conseguir vinos con una mayor influencia de los aromas impartidos por estos tioles en función del aroma final deseado.
CONCLUSIONES GENERALES Se han desarrollado métodos de análisis selectivos para tres familias de compuestos (metoxipirazinas, ácidos grasos e hidroxi ácidos grasos) que se encuentran a nivel traza en vino y otras bebidas alcohólicas.
Se ha buscado la selectividad de los métodos a través del uso de las propiedades ácido-base de los analitos para retenerlos o eluírlos de forma selectiva en resinas de extracción en fase sólida. Además en el caso de los ácidos se ha recurrido a la derivatización para mejorar tanto la selectividad como la sensibilidad. En todos los casos se han explorado distintas posibilidades de mejora en los procesos de separación y detección instrumental, buscando igualmente mejoras en tanto en selectividad como en sensibilidad.
Estos métodos de análisis han sido validados y posteriormente utilizados en el análisis de lotes de muestras caracterizados por sus bajos niveles de concentración (metoxipirazinas) o por ser los primeros datos que se publican sobre estos compuestos (ácidos e hidroxi ácidos grasos) y que han proporcionado los primeros indicios sobre su posible origen biológico.
El análisis de compuestos orgánicos a nivel traza, especialmente en matrices complejas como el vino, requiere optimizar al máximo todas las etapas del método, desde la preparación de muestra hasta la separación y detección instrumentales para minimizar las posibles interferencias que finalmente puedan condicionar el análisis debido a co-eluciones y para maximizar el factor de concentración y sensibilidad global del método.
El control de la suciedad del sistema y de los extractos es crítico a nivel de análisis traza porque puede condicionar la cuantitatividad de los mismos. La influencia de los propios extractos analizados es clara, pero también el ¿historial¿ del sistema utilizado debe ser tenido en cuenta, pues puede llegar a ser tan devastador para el análisis como la suciedad de los propios extractos o incluso más en función de las características de los análisis precedentes.
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