Introducción de forma estable de genes de la nodulación en el plásmido simbiótico de Rhizobium leguminosarum bv. trifolii RS1051
- Autores: Carolina Sousa Martín
- Directores de la Tesis: Manuel Megías Guijo (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Sevilla ( España ) en 1992
- Idioma: español
- Número de páginas: 267
- Tribunal Calificador de la Tesis: Francisco Ruiz Berraquero (presid.), Ramón Andrés Bellogín Izquierdo (secret.), Miguel Angel Gutierrez Navarro (voc.), Nicolás Toro García (voc.), Antonio Palomares Díaz (voc.)
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- Tesis en acceso abierto en: Idus
- Resumen
Una de las técnicas más poderosa usadas en la investigación de Rhizobium es la mutagénesis dirigida descrita por Ruvkun y Ausubel (1981). La estrategia consiste en obtener inserciones de un transposón en un fragmento clonado de ADN mantenido en E. coli, como organismo intermediario, utilizando vectores de amplio rango de hospedador para conjugarlos desde E. coli hasta Rhizobium. Posteriormente, se transfieren determinadas inserciones al genoma del organismo original por recombinación homóloga, introduciendo en las células un plásmido del mismo grupo de incompatibilidad del que se introdujo al principio. De particular interés es el trabajo de Innes y col. (1988), en el que mediante la técnica de doble recombinación homóloga, determinaron que un fragmento de 32 kb del pSym de la cepa ANU843 de R. leguminosarum bv. trifolii es capaz de conferir nodulación y fijación de nitrógeno cuando se introduce en la misma cepa curada de su pSym.
Entre las especies de Rhizobium, la transferencia de material genético, se puede llevar a cabo bien por transducción (Casadesús y Olivares 1979; Finan y col. 1984) o por conjugación, éste último es el método más ampliamente utilizado. La transferencia por conjugación del pSym de una especie de Rhizobium a otra es una estrategia muy útil para identificar genes que intervienen en la simbiosis, al mismo tiempo que se obtienen cepas con determinadas propiedades simbióticas. La cepa receptora para estos experimentos puede ser una estirpe silvestre o bien, una estirpe de la misma o de diferente especie afectada en sus propiedades simbióticas. En nuestro Departamento se han realizado experimento de pérdida del pSym que obligatoriamente conlleva a la ausencia de nodulación (Rodríguez-Quiñones y col. 1989), pero la reintroducción del pSym propio de la cepa o de otra cepa (o especie) diferente planteaba situaciones en las que se podía o no producir el proceso de la nodulación.
En nuestro Departamento se viene estudiando desde hace ya algunos años, la interacción R. leguminosarum bv. trifolii RS1051-trébol. Así por ejemplo Megías y col. (1982) establecieron el mapa de ligamiento del cromosoma de esta cepa, situando 17 marcadores nutricionales y de resistencia utilizando el R68.45 como plásmido movilizador (Beringer y Hopwood 1976; Kondorosi y col. 1977; Casadesús y Olivares 1979; Scott y Ronson 1982). Posteriormente Megías y col. (1988) ampliaron el conocimiento del mapa de ligamiento de esta cepa, mediante el aislamiento y caracterización de mutantes auxotróficos de histidina obtenidos por mutagénesis con nitrosoguanidina y mediante transposición con Tn5. Más tarde, Rodríguez-Quiñones y col. (1989) comenzaron los estudios moleculares sobre la información genética de la cepa RS1051, construyendo un banco de genes de la misma a partir de cual se localizaron los genes de la nodulación de esta cepa. Coronado y col. (1990) ampliaron los estudios de esta cepa, localizando los genes ndvA y ndvB.
Dados estos antecedentes y la disponibilidad del material biológico que teníamos hasta ese momento, se pretendió como OBJETIVO PRINCIPAL de este estudio, introducir genes simbióticos mediante doble recombinación homóloga, en el pSym de la cepa RS1051 de R. leguminosarum bv. trifolii analizando las características simbióticas que conferían a hospedadores específicos o no específicos de esta cepa.
El primer objetivo que nos trazamos fue la reconstrucción de cepas con un fenotipo Nod-, derivadas de la cepa silvestre (por delecciones variables en su pSym), mediante la introducción de los genes de la nodulación obtenidos a partir del banco de genes de la cepa silvestre. De esta forma pretendíamos que estas cepas adquirieran, de nuevo, la capacidad de nodular plantas de trébol.
El segundo punto que consideramos de interés fue el ampliarle el rango de hospedador de la cepa RS1051 para que adquiriese la capacidad de nodular plantas de alfalfa. Para ello introducimos en esta cepa los genes de “especificidad” de la cepa silvestre de R. meliloti 41.
Por último basándonos en resultados preliminares obtenidos por Vargas y col. (1990), que indicaban que en R. tropici CIAT899 el gen nodD es un determinante en la especificidad de hospedador, dirigimos parte de nuestras investigaciones al estudio de una cepa derivada de R. leguminosarum bv. trifolii RS1051 a la que previamente le habíamos introducido un fragmento del gen nodD (en concreto la región amino terminal de la proteína NodD). Quisimos comprobar si este fragmento, efectivamente, era suficiente para que esta cepa fuera capaz de nodular plantas de frijol, que es uno de los huéspedes de R. tropici CIAT899.
CONCLUSIONES:
1. Los fragmentos de ADN elegidos como zonas de homología fueron adecuados dado que las dianas únicas de restricción XhoI, EcoRI, SalI, SmaI, BglII y BamHI permiteron la clonación de genes con la homología necesaria para que tenga lugar la doble recombinación homóloga.
2. Los cósmidos pCR1 y pCS110 permitieron introducir genes de nodulación en el plásmido simbiótico de Rhizobium leguminosarum bv. trifolii RS1051.
3. Los genes de la nodulación (nodABC, nodD y nodFEL) de Rhizobium leguminosarum bv. trifolii introducidos en plásmidos simbióticos deleccionados de Rhizobium leguminosarum bv. trifolii RS1051 no fueron suficientes para restaurar la nodulación efectiva de las cepas indicadas en plantas de Trifolium subterraneum.
4. Los genes de especificidad (nodFEG y nodH) de Rhizobium meliloti 41 introducidos en el plásmido simbiótico de Rhizobium leguminosarum bv. trifolii RS1051 amplian el rango de hospedador de esta cepa para nodular plantas de Medicago sativa, dando lugar a nódulos efectivos.
5. La introducción del fragmento de 0,52 kb del gen nodD de Rhizobium tropici CIAT899 en el plásmido simbiótico de Rhizobium leguminosarum bv. trifolii RS1051 amplia el rango de hospedador de esta cepa hasta plantas de Phaseolus vulgaris.
