Nuevas perspectivas de la microextracción en fase sólida acoplada a cromatografía de gases con detección mediante emisión atómica
- Autores: Rosa María Peñalver Soler
- Directores de la Tesis: Manuel Hernández Córdoba (dir. tes.), Natalia Campillo Seva (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Murcia ( España ) en 2009
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Alberto Barba Navarro (presid.), María Pilar Viñas López-Pelegrín (secret.), Sonia Ramírez García (voc.), Encarnación Rodríguez Gonzalo (voc.), María Luisa Marina Alegre (voc.)
- Materias:
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- Resumen
En la presente Memoria se reúnen los resultados obtenidos durante la realización de la Tesis Doctoral titulada "Nuevas perspectivas de la microextracción en fase sólida acoplada a cromatografía de gases con detección mediante emisión atómica". El denominador común de todos los trabajos presentados es el acoplamiento de la cromatografía de gases con la detección mediante emisión atómica (GC-AED), habiendo sido empleada para la determinación de diversos compuestos orgánicos y organometálicos en muestras medioambientales, alimentos y bebidas. Teniendo en todo momento en mente la necesidad del desarrollo de métodos analíticos que pudiesen ser englobados dentro de la llamada "Química Analítica Verde", el tratamiento de las muestras se llevó a cabo mediante microextracción en fase sólida (SPME), técnica que permite la extracción de los analitos desde la matriz de la muestra y la preconcentración de los mismos, eludiendo la inclusión de una etapa de limpieza de los extractos, sin uso ni generación de disolventes orgánicos nocivos para el medioambiente y la salud humana. Esta técnica de preconcentración pudo ser aplicada con éxito a nueve de los diez trabajos presentados en esta Memoria, sin embargo, para la especiación de arsénico todos los intentos para su inclusión en el procedimiento analítico global fueron infructuosos.
La estructura de la presente Tesis Doctoral consiste en primer lugar en una Introducción general, en la que se presentan, en líneas generales, las características del sistema de detección empleado y las nuevas perspectivas en cuanto a tratamientos de muestras, cerrando dicha Introducción con un apartado dedicado íntegramente al sistema de preconcentración SPME. Seguidamente se presentan los Resultados Experimentales y Discusión de los mismos, los cuales se dividen en cada uno de los capítulos desarrollados en la Tesis, un total de diez, agrupados en tres bloques.
1. En el primer bloque se incluyen las aplicaciones de la hibridación SPME-GC-AED para la determinación de pesticidas y clorofenoles en miel.
La miel de abeja presenta cualidades reconocidas que la convierten en un alimento con efectos altamente beneficiosos para la salud humana, razón por la que su consumo se ha ido incrementando a lo largo de los tiempos, lo que justifica la importancia del control de calidad de este producto. Por ello, en el primer Capítulo de la presente Memoria, se llevó a cabo la determinación de 16 pesticidas de diferentes familias químicas (organoclorados, organofosforados y piretrinas) en miel. La capacidad multielemental del detector permitió proponer un procedimiento de análisis común para la detección y cuantificación de las diferentes familias de pesticidas por monitorización de las líneas de emisión de cloro (479 nm), bromo (478 nm) y azufre (181 nm); asimismo la selectividad del sistema de detección proporcionó cromatogramas específicos sin picos interferentes. Se consiguió desarrollar un método fiable y útil para monitorizaciones rutinarias de pesticidas en muestras de miel. Es importante mencionar que ninguna de las muestras analizadas contenía los compuestos estudiados a niveles de concentración superiores a los correspondientes límites de detección obtenidos.
En el segundo Capítulo de esta Tesis Doctoral, se desarrolló un método rápido para la determinación de nueve clorofenoles en muestras de miel usando microextracción en fase sólida en el modo de espacio de cabeza. Este modo de extracción mediante SPME permite además de obtener en este caso una mejora de la sensibilidad, alargar el tiempo de vida de las fibras empleadas al no permanecer éstas en contacto con el medio de extracción. En el procedimiento presentado los clorofenoles son derivatizados mediante una reacción de acetilación empleando anhídrido acético como agente derivatizante, aportando importantes ventajas cromatográficas y de sensibilidad, con la ventaja de que la reacción de derivatización tiene lugar en la propia disolución acuosa de la muestra y por tanto evitando etapas previas de extracción en disolventes orgánicos. El método optimizado se aplicó con éxito, encontrándose algunos de los clorofenoles bajo estudio, en varias muestras, en el intervalo de concentraciones 0,4-9,4 ng g-1.
Dado que las condiciones SPME seleccionadas para el análisis del conjunto de clorofenoles tratado en el Capítulo II, no eran las óptimas para la determinación del pentaclorofenol (PCP), teniendo en cuenta la importancia de la cuantificación de este carcinogénico compuesto, en el Capítulo III focalizamos nuestro objetivo hacia la puesta a punto de un procedimiento analítico para la determinación del compuesto más tóxico de la familia de los clorofenoles, con mayor sensibilidad que la obtenida en el segundo capítulo. De nuevo se llevó a cabo la acetilación del PCP para mejorar las condiciones de su determinación. En este Capítulo se mejoran los límites de detección, alrededor de un orden de magnitud, con respecto a los obtenidos en el Capítulo anterior. Obsérvese que nos referimos a límites de detección para un único analito pues su cuantificación está directamente relacionada con la matriz de cada muestra. Además el procedimiento propuesto se aplicó no sólo a mieles de abeja sino también a otros productos relacionados con la misma, así como a mieles vegetales y a gelatina, proponiendo aquí tratamientos de muestra mucho más rápidos y sencillos que los previamente publicados para la determinación de PCP en gelatinas.
Se encontraron niveles de PCP en el intervalo de 0,3 a 1,5 ng g-1 en todas las muestras de miel de abeja, no detectándose en las otras muestras bajo análisis salvo en una muestra de gelatina. Merece la pena destacar que en ninguno de los casos podemos afirmar que la miel no sea apta para el consumo humano.
Finalmente citaremos que las fibras empleadas para la determinación de los pesticidas fueron de polidimetilsiloxano (PDMS) de 100 µm de grosor, mientras que para los clorofenoles, los mejores resultados se obtuvieron con la combinación de polidimetilsiloxano con divinilbenceno (PDMS/DVB, 65 µm).
2. El segundo bloque que lleva por título "Aplicaciones de la cromatografía de gases con detección por emisión atómica para distintas determinaciones en otros alimentos y bebidas", incluye los siguientes cinco Capítulos que integran la presente Memoria (Capítulos IV-VIII).
El Capítulo IV se centra en el desarrollo de un método analítico para la determinación de diez pesticidas de distintas familias químicas en diferentes tipos de infusiones mediante SPME-GC-AED. En este caso, los analitos previamente concentrados en una fibra de PDMS de 100 µm, una vez separados cromatográficamente pudieron ser monitorizados en las líneas de emisión de cloro y bromo, evitando así tener que llevar a cabo un segundo análisis para cada muestra como ocurría en el Capítulo I para la monitorización de la línea de azufre. Habiéndose comprobado la existencia de diferencias significativas entre las pendientes de calibración acuosa y las obtenidas mediante el método de adiciones estándar a las muestras, se observó que no existían dichas diferencias cuando se comparaban las pendientes de adiciones estándar obtenidas de diferentes muestras de infusiones. Por tanto, la cuantificación de las muestras se pudo llevar a cabo utilizando como medio de calibración una infusión preparada a partir de una muestra de té exenta de los analitos. Se encontraron algunos de los pesticidas estudiados en tres de las muestras analizadas en concentraciones comprendidas entre 0,2 y 0,9 ng ml-1, verificándose la identidad de estos compuestos mediante el acoplamiento de la cromatografía de gases con la espectrometría de masas (GC-MS).
El Capítulo V se centra en la determinación de doce haloanisoles en diferentes muestras de vinos y bebidas alcohólicas. La presencia de estos haloanisoles en los vinos puede ser el origen de ciertos defectos en los mismos, catalogándolos como picados, mohosos, con sabor a plástico, etc. Estos defectos suponen importantes pérdidas económicas para la industria vinícola, por lo que la disponibilidad de métodos de análisis sensibles y de fácil aplicación para su determinación es siempre interesante. La dilución de las muestras (en proporciones 3:4 y 1:6 (muestra:agua) para vinos y licores, respectivamente) unida al uso de estándar interno (5-B-4-CA) permitió la cuantificación de las muestras frente a estándares externos preparados en presencia de un 5% (v/v) de etanol. El método optimizado se aplicó con éxito a diferentes muestras, encontrándose algunos de los anisoles a niveles de concentración comprendidos entre 10,3 ng l-1 y 1,14 ng ml-1. Cabe señalar que los límites de detección alcanzados fueron lo suficientemente bajos como para determinar concentraciones de estos compuestos dentro de los niveles de percepción olfativa y gustativa de los mismos.
El Capítulo VI está centrado en el desarrollo de un método analítico para la determinación de compuestos volátiles orgánicos de selenio (VOSeCs) y azufre (VOSCs). El objeto de este Capítulo está íntimamente relacionado con el del anterior, ya que se trata de compuestos que en la mayoría de los casos afectan a las propiedades sensoriales de vinos, cervezas y otras bebidas alcohólicas. El efecto de haloanisoles y VOSCs sobre los vinos y otras bebidas se encuentra publicado en la bibliografía, no siendo así para VOSeCs, siendo considerados por nosotros en el Capítulo VI por su similitud con VOSCs. El interés del control de la calidad de bebidas como vinos y cervezas radica en las numerosas propiedades que presentan para la salud humana, destacando entre ellas su poder antioxidante y su capacidad de minimizar la aparición de enfermedades cardiovasculares, siempre que su uso sea moderado.
Del mismo modo que en el Capítulo V, pudo evitarse la cuantificación de las muestras mediante adiciones estándar a las mismas, conjugando la inclusión de la dilución de las muestras (5:15 y 2:18 (muestra:agua) para vinos y licores, respectivamente) y el uso de estándares internos (etilmetilsulfuro e isopropildisulfuro para VOSCs de alta y baja volatilidad, respectivamente). Para la cuantificación de cervezas se empleo como medio de calibración una disolución sin diluir preparada simulando cerveza sintética, en el caso de los vinos una disolución simulando un vino sintético diluido en la proporción citada y para los licores el alto grado de dilución seleccionado permitió calibrar con una muestra real exenta de los analitos. Se analizaron cuarenta muestras diferentes bajo el método optimizado, encontrándose algunos de los VOSCs estudiados a niveles de concentración dentro del intervalo 0,04-152 ng ml-1. Por otro lado no se detectaron los VOSeCs en ninguna muestra. Es importante mencionar que los valores obtenidos para dimetildisulfuro fueron inferiores a los valores encontrados en la bibliografía como umbrales de percepción. Sin embargo, el contenido de dimetilsulfuro (DMS) en una de las muestras de vino tinto se hallaba en su correspondiente intervalo de percepción.
En el Capítulo VII se presenta un procedimiento analítico para la determinación de dimetilseleniuro (DMSe) y dimetildiseleniuro (DMDSe), mediante microextracción en fase sólida, bajo el modo de espacio de cabeza empleando una fibra de Carboxen y polidimetilsiloxano, acoplada a GC-AED, en leche y productos lácteos. En este caso, la complejidad de la matriz de las muestras no nos permitió obviar el método de adiciones estándar para la cuantificación de las mismas. Se comprobó que la grasa contenida en las muestras era uno de los factores que provocaba el citado efecto matriz para los dos compuestos estudiados, encontrándose que el contenido de caseína y lactalbúmina afectaba a la sensibilidad de DMDSe, no observándose ningún efecto sobre DMSe con la presencia de dichas proteínas. Los límites de detección obtenidos variaron desde 70 a 110 pg ml-1 para DMSe y de 80 a 400 pg ml-1 para DMDSe, dependiendo de la muestra líquida analizada; en el caso de las muestras de yogur los límites de detección obtenidos fueron de 40 y 95 ng g-1 para DMSe y DMDSe, respectivamente. Estos datos muestran el hecho de que la sensibilidad de cada compuesto no sólo depende del número de átomos, correspondiente al heteroátomo monitorizado, contenidos en la fórmula molecular, sino también (y en gran extensión) de la volatilidad y afinidad del compuesto hacia la fase estacionaria de la fibra empleada para su extracción y preconcentración.
El Capítulo VIII, que es el último del segundo bloque, muestra una diferencia clara en el método propuesto respecto de aquellos detallados en el resto de capítulos de esta Memoria, ya que no fue posible la preconcentración de los analitos derivatizados mediante SPME. La extracción y preconcentración de los compuestos de arsénico estudiados (monometilarseniato, dimetilarseniato y arsénico inorgánico) se llevó a cabo mediante la técnica de extracción líquido-líquido (LLE). A pesar de ello, la ausencia de picos interferentes en los cromatogramas obtenidos permitía una identificación inequívoca de los analitos, no requiriéndose ninguna etapa adicional de limpieza de los extractos orgánicos.
El arsénico presenta mayor toxicidad en sus formas inorgánicas que bajo los compuestos organoarsenicales estudiados en este capítulo, por lo que resulta de especial interés la especiación de este elemento. Los analitos se derivatizaron en la disolución de la muestra con tioglicolato de metilo (TGM), siendo así extraidos en ciclohexano, inyectándose en el cromatógrafo una alícuota de esta fase orgánica. El procedimiento se aplicó a diferentes muestras líquidas como aguas de mar, vinos y cervezas y también a diferentes variedades de alimentos infantiles, teniendo que aplicar una hidrólisis enzimática para estas últimas muestras de forma previa a la extracción de los analitos en el disolvente orgánico. Además, todas las muestras fueron también analizadas por generación de hidruros y espectrometría de fluorescencia atómica (HG-AFS), obteniéndose datos relativos a su contenido total de arsénico, confirmando que la única forma de arsénico presente en las muestras líquidas analizadas era la de arsénico inorgánico. En el caso de los alimentos infantiles basados en pescado los altos contenidos de arsénico encontrados se atribuyeron a la forma no tóxica, arsenobetaína. La estimación de la fiabilidad del procedimiento propuesto para el análisis de alimentos infantiles se llevó a cabo utilizando un material de referencia certificado a diferencia de las otras muestras y el resto de procedimientos analíticos presentados en esta Tesis, para los que no disponiendo de materiales de referencia adecuados, dicha estimación se realizó mediante estudios de recuperación.
3. Finalmente presentamos el último bloque de la Tesis Doctoral, que lleva por título: "Aplicaciones de la SPME acoplada a la cromatografía de gases con detección por emisión atómica para la determinación de compuestos organometálicos en muestras medioambientales", que pudo llevarse a cabo gracias a la capacidad multielemental del detector empleado.
El primer Capítulo incluido dentro de este último bloque (Capítulo IX) presenta la comparación de dos agentes derivatizantes para la determinación simultánea de selenio en forma inorgánica y especies orgánicas de selenio, preconcentrando los analitos derivatizados de forma previa a su separación cromatográfica mediante SPME.
El proceso de derivatización tuvo que ser incluido en el procedimiento analítico para convertir las especies inorgánicas de selenio en compuestos volátiles. En este sentido, se compararon dos reactivos derivatizantes diferentes: tetraetilborato sódico (NaBEt4) y 4,5-dicloro-1,2-fenilendiamina, optimizándose para cada caso las condiciones de extracción mediante SPME así como las cromatográficas y de detección. La sensibilidad alcanzada fue mayor empleando 4,5-dicloro-1,2-fenilendiamina, presentando como desventajas frente al uso de NaBEt4 el hecho de que fue necesario sumergir la fibra en la disolución de la muestra para extraer los tres analitos y que la duración de la etapa de extracción fue mayor. Para muestras con altos contenidos en los compuestos bajo estudio se seleccionaría la derivatización con NaBEt4, que permite extraer los analitos desde el espacio de cabeza, alargando la durabilidad de las fibras, siendo además menor la duración de la etapa de extracción.
Finalmente el último Capítulo de esta Tesis Doctoral se basa en la determinación de dos compuestos orgánicos de manganeso, ciclopentadienil tricarbonil manganeso (CMT) y su derivado metilciclopentadienil tricarbonil manganeso (MMT), en aguas de mar y suelos. Dado que los analitos eran extraídos desde el espacio de cabeza de la disolución de las muestras, no fue necesario separar las partículas sólidas de suelo del medio de extracción para proceder a la etapa de SPME. La cuantificación de las aguas de mar se llevó a cabo mediante calibración con estándares externos; sin embargo, para la cuantificación de los suelos hubo de aplicarse el método de adiciones estándar. Se alcanzaron límites de detección muy bajos, del orden de los pg Mn l-1 en aguas de mar y pg Mn g-1 en suelos. Se encontró MMT en una de las siete muestras de suelo analizadas, aunque el contenido se hallaba por debajo del correspondiente límite de cuantificación.
Por lo tanto, podemos concluir que los procedimientos puestos a punto en esta Tesis Doctoral permiten determinar compuestos orgánicos y organometálicos en diferentes tipos de muestras mediante la técnica de cromatografía gaseosa con detector de emisión atómica implicando tratamientos de las muestras muy sencillos y rápidos, obteniéndose en todos los casos porcentajes de recuperación y límites de detección altamente aceptables, empleando en la mayoría de los casos como técnica de preconcentración la microextracción en fase sólida que puede ser incluida dentro del ámbito de la "Química Analítica Verde", ya que elimina el uso y/o generación de disolventes orgánicos.
