Desarrollo de nuevas estrategias de extracción para la obtención de compuestos bioactivos

• Autores: Andrea del Pilar Sánchez Camargo
• Directores de la Tesis: Elena Ibañez Ezequiel (dir. tes.), Virginia García Cañas (dir. tes.), Miguel Herrero Calleja (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2017
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Alejandro Cifuentes Gallego (presid.), Mónica Rodríguez García-Risco (secret.), Marichel Plaza del Moral (voc.)
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Biología humana
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Biblos-e Archivo
• Resumen

  • RESUMEN En la última década, la investigación sobre compuestos bioactivos procedentes de fuentes naturales ha suscitado una gran atención debido al creciente interés de la población en el consumo de alimentos funcionales que puedan promover efectos beneficiosos para la salud. Este interés también se ha visto potenciado por el progresivo aumento en la incidencia de ciertas enfermedades crónicas, como el cáncer de colon que, según diversos estudios, posee una relación directa con la dieta. Entre las diferentes fuentes naturales para la obtención de compuestos bioactivos, las plantas y, específicamente, las hierbas y especias, han sido las fuentes naturales más estudiadas debido a sus usos en medicina tradicional. No obstante, las algas marinas también han demostrado un gran potencial. Para la extracción de estos compuestos, el uso de bio-disolventes como CO2, etanol y agua en estado sub- y supercrítico se ha estudiado ampliamente en los últimos años, demostrando su viabilidad tecnológica en un gran número de aplicaciones. No obstante, recientemente, se ha propuesto un enfoque más holístico acerca de los principios básicos para la extracción “verde” de productos naturales. Estos principios incluyen el uso de recursos vegetales renovables, el uso de disolventes alternativos, la recuperación de energía y el empleo de tecnologías innovadoras, reduciendo las operaciones unitarias y favoreciendo el diseño de procesos seguros y la generación de co-productos en lugar de residuos, donde el concepto de agro- y biorrefinerías cobra un papel importante (Capítulo 1). Así, teniendo en cuenta este enfoque, el objetivo de la presente Tesis Doctoral ha sido el desarrollo de nuevas estrategias de extracción para la obtención de compuestos bioactivos empleando como fuentes naturales, romero (Rosmarinus officinalis), dos tipos de algas marrones, Sargassum muticum y Cystoseira abies-marina, y una microalga, Phaeodactylum tricornutum.

    Inicialmente, se estudió la integración e intensificación de diferentes procesos de extracción empleando CO2 supercrítico (SC-CO2) para la obtención y fraccionamiento selectivo de extractos de romero, con potencial actividad inhibitoria de la proliferación celular in vitro en dos modelos de células de cancer de colon, HT-29 y HCT116 (Capítulo 4, sección 4.1). De los dos procesos desarrollados en la presente Tesis Doctoral (extracción secuencial con fluidos supercríticos en 2 etapas y extracción con líquidos presurizados combinada con fraccionamiento supercrítico antisolvente (PLE+SAF)), el fraccionamiento supercrítico antisolvente de un extracto hidroalcohólico obtenido mediante PLE, proporcionó los extractos de romero más activos en ambas líneas celulares. Éstos se caracterizaron por poseer concentraciones de ácido carnósico y carnosol en el extracto superiores al 26% y 3% (p/p), respectivamente.

    Posteriormente, se llevó a cabo el estudio de diferentes técnicas de extracción de compuestos bioactivos de algas marinas, como la extracción asistida por enzimas (EAE), la extracción con líquidos presurizados (PLE) y la extracción con SC-CO2 (SFE) empleando modificadores alternativos. Además, se utilizaron herramientas teóricas de predicción de solubilidad para la selección del bio-disolvente que mejorase la selectividad del proceso (Capítulo 4, sección 4.2). El uso de técnicas analíticas avanzadas como la cromatografía de líquidos bidimensional completa acoplada a espectrometría de masas (LC × LC-MS/MS) fue clave para la caracterización de los extractos obtenidos a partir de algas marrones. En relación al alga Sargassum muticum, la PLE demostró ser la técnica de extracción más eficiente para la extracción de florotaninos, entre los cuales se pudieron identificar como más abundantes diferentes fuhaloles, hidroxifuhaloles y floretoles con grados de polimerización entre 3 y 11 unidades. Tras el estudio de muestras de este alga recolectadas en diferentes localizaciones geográficas a lo largo de las costa Altántica, las procedentes de Noruega se revelaron como las más activas en células de cáncer de colon HT-29. Por otra parte, la identificación de los florotaninos más abundantes en los extractos de PLE de Cystoseira abies-marina mostró la predominancia de heptafucoles o heptafloretoles; la estimación teórica de sus parámetros de solubilidad permitió confirmar que el etanol era el disolvente más selectivo para su extracción. En relación a la microalga Phaeodactylum tricornutum, la estimación teórica de los parámetros de solubilidad de fucoxantina permitió determinar que el disolvente más selectivo para su extracción era el d-limoneno. Asimismo, el empleo de PLE en un ciclo utilizando este bio-disolvente, se mostró como la más apropiada para obtener extractos ricos en el carotenoide fucoxantina.

    Los resultados derivados de estos trabajos han sido publicados en revistas científicas internacionales del área de Química, Ingeniería Química y Ciencia y Tecnología de Alimentos, sumando un total de 7 artículos de investigación originales (6 publicados y uno actualmente en proceso de revisión), y 2 artículos de revisión (aceptados) en revistas incluidas en el SCI, además de 3 capítulos de libros (aceptados) y un artículo de revisión en una revista no-SCI.

    SUMMARY In the last decade, there has been a growing interest in the research on bioactive compounds from natural sources that can be employed as functional food ingredients to help in the prevention of certain diseases, such as colon cancer, which occurrence has a strong relationship with diet. Among the different natural sources to obtain bioactive compounds, plants and, more specifically, herbs and spices have been the most-widely studied due to their traditional medicinal use; however, marine algae have also demonstrated a huge potential. To extract these bioactive compounds, bio-based solvents such as CO2, ethanol and water at sub- and supercritical conditions have been widely studied and have demonstrated their technological ability in an important number of applications. Nevertheless, more recently, a holistic approach on the principles of “green extraction” of natural products has been proposed, including the use of renewable vegetable sources, the employment of alternative solvents, the maximization of energy recovery and the use of innovative technologies. The main goal of this strategy is to reduce unit operations, to foster the development of safer processes and to generate co-products instead of by-products, approaching the concept of agro- and biorefinery (Chapter 1).

    Therefore, considering this perspective, the objective of the present PhD Thesis has been the development of new extraction strategies to obtain bioactive compounds from natural sources such as rosemary (Rosmarinus officinalis), seaweeds (Sargassum muticum and Cystoseira abies-marina) and microalgae (Phaeodactylum tricornutum).

    Initially, the integration and intensification of different extraction processes based on the use of supercritical CO2 (SC-CO2) was studied to extract and selectively fractionate rosemary extracts with potential inhibitory activity against the proliferation of human colon cancer cell lines, HT-29 and HCT116 (Chapter 4, section 4.1). Among the different processes developed in the present work (two-step sequential supercritical fluid extraction and pressurized liquid extraction-supercritical antisolvent fractionation (PLE+SAF)), those obtained using supercritical antisolvent fractionation (SAF) provided with the most active rosemary extracts against both colon cancer cell lines. Those extracts possessed carnosic acid and carnosol concentrations higher than 26% and 3% (w/w), respectively.

    Later on, the study of different extraction processes (such as enzyme-assisted extraction (EAE), pressurized liquid extraction (PLE) and supercritical fluid extraction (SFE) using SC-CO2 and alternative co-solvents) was carried out to extract bioactive compounds from algae. Moreover, theoretical tools to predict the solubility of the target compounds on different bio-based solvents were employed to improve the selectivity of the extraction processes (Chapter 4, section 4.2). The use of advanced analytical techniques such as comprehensive two-dimensional liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC × LC-MS/MS) was critical to chemically characterize the extracts from the studied brown seaweeds. For Sargassum muticum, PLE was the most efficient extraction technique for the recovery of phlorotannins; fuhaols, hydroxyfuhaols and phloretols (with degrees of polymerization ranging between 3-11 units) were the most abundant among the identified phlorotannins. Among the different Sargassum muticum samples studied collected along the Atlantic coast, those grown in Norway were the most active against HT-29 colon cancer cells. On the other hand, heptafucols and heptaphloretols were the most abundant phlorotannins found in Cystoseira abies-marina PLE extracts; the theoretical estimation of their solubility parameters demonstrated that ethanol was the best solvent in terms of selectivity towards the extraction of these compounds. As for Phaeodactylum tricornutum microalgae, the theoretical prediction of the solubility parameters of fucoxanthin (the most active compound) demonstrated that d-limonene was the most selective solvent towards this carotenoid. Moreover, one-cycle PLE using d-limonene as extracting solvent was the most appropriate extraction process to obtain fucoxanthin-rich extracts from this organism.

    The results obtained during the development of this PhD have resulted in the publication of 7 original research articles (6 published and one submitted for publication) and 2 reviews in scientific journals included in the SCI (within Chemistry, Chemical Engineering and Food Science and Technology categories). Besides, 3 international book chapters (2 published and one accepted) and one review paper in a No-SCI Journal have also been published.