Evaluación toxicológica in vitro e in vivo de compuestos organosulfurados con potencial uso en envasado activo en contacto con alimentos
- Autores: María del Pilar Mellado García
- Directores de la Tesis: Ana María Cameán Fernández (dir. tes.), María Puerto Rodríguez (dir. tes.), Silvia Pichardo Sánchez (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Sevilla ( España ) en 2017
- Idioma: español
- Número de páginas: 203
- Tribunal Calificador de la Tesis: Guillermina Font Pérez (presid.), Ana Isabel Prieto Ortega (secret.), Rosario Moyano Salvago (voc.), Bojana Zegura (voc.), Ana María Bermejo Barrera (voc.)
- Programa de doctorado: Programa de Doctorado en Farmacia por la Universidad de Sevilla
- Materias:
- Enlaces
- Tesis en acceso abierto en: Idus
- Resumen
- español
En la actualidad, la industria alimentaria está apostando por la incorporación de sustancias naturales a envases alimentarios con el fin de incrementar la perdurabilidad de los alimentos en el mercado. Con estas prácticas se intentan satisfacer las necesidades de los consumidores de tal modo que su uso suponga ventajas tecnológicas y beneficios para el consumidor. Sin embargo, para que una sustancia sea admitida como aditivo debe estar bien caracterizada químicamente y debe superar los controles toxicológicos establecidos por parte de los correspondientes organismos sanitarios debido al desconocimiento del uso de estos componentes y sus posibles consecuencias. Entre las sustancias naturales que se emplean con este fin destacan los AEs, los cuales han sido tradicionalmente utilizados por sus propiedades farmacológicas. En nuestro caso, tanto un extracto del género Allium, denominado comercialmente PROALLIUM AP®, como alguno de sus componentes (PTSO y su análogo PTS) pretenden ser utilizados como antimicrobianos en la industria alimentaria formando parte de envases activos. Como paso previo al estudio de su seguridad se realizó una revisión bibliográfica de los datos de toxicidad disponibles hasta el momento en la literatura científica, tras la cual se puso de manifiesto la ausencia de estudios requeridos en diferentes compuestos con interés en la conservación de alimentos y la disparidad de los resultados disponibles. La evaluación toxicológica realizada en la presente tesis doctoral comenzó con una batería de ensayos tanto in vitro, con células que estarían en contacto con estas sustancias al ser ingeridas, como in vivo, en ratas tras un consumo agudo y crónico, para investigar los posibles efectos tóxicos, destacando los estudios de genotoxicidad, que pueden desencadenarse tras la exposición a PROALLIUM AP®, PTSO y PTS. La relevancia de la información toxicológica de estas sustancias resulta fundamental para su futuro uso ya que constituye un requisito reglamentario por parte de las autoridades competentes antes de su comercialización. Todos estos experimentos dieron lugar a las siguientes publicaciones: GENOTOXICITY ASSESSMENT OF PROPYL THIOSULFINATE OXIDE, AN ORGANOSULFUR COMPOUND FROM ALLIUM EXTRACT, INTENDED TO FOODACTIVE PACKAGING. (Mellado-García y cols., 2015), Food and Chemical Toxicology 86, 365-373. La vía de exposición más importante en el contexto que nos engloba es la vía oral ya que una vez el extracto de PROALLIUM AP® sea incorporado en films en envases activos, PTSO podría ser ingerido por los consumidores. En este trabajo, las células Caco-2 (adenocarcinoma de colon), fueron expuestas a diferentes concentraciones en función de la concentración máxima que migraría del film al consumidor en el peor escenario posible. Los experimentos llevados a cabo incluyen la evaluación de la mutagenicidad de PTSO en diferentes cepas de S. typhimurium (0-20 μM) cada una con características diferentes alteradas genéticamente para presentar mutaciones en los genes implicados en la síntesis de histidina para abarcar un amplio rango de posibles mutaciones. También se estudió la mutagenicidad en las células L5178Y TK+/- de mamíferos (ensayo de MLA), tras la realización de un estudio de citotoxicidad previo, en el que se determinaron las concentraciones de exposición a 4h (0-30 μM) y a 24h (0-20 μM). En el caso del test de Ames, no hubo diferencias significativas en ninguna de las cepas estudiadas en ausencia ni en presencia de S9. Sin embargo, a las 24 h de exposición en el ensayo de MLA se observaron diferencias significativas en el recuento de colonias en el rango de 2,5-20 μM. Por otro lado, PTSO no indujo incrementos en el porcentaje de MN (0-40 μM) en ausencia de S9 a ninguna de las concentraciones ensayadas, pero sí en presencia de la fracción microsómica S9 a partir de 15 μM, indicando la genotoxicidad de su metabolito. Por último, el ensayo cometa (0-50 μM) no mostró rotura ni daño oxidativo en el ADN de las células Caco-2 tratadas. Posteriormente, teniendo en cuenta los resultados contradictorios de genotoxicidad de PTSO in vitro, siguiendo las recomendaciones de la EFSA (EFSA 2011), se procedió al estudio de la genotoxicidad in vivo de PTSO en ratas Wistar, mediante el siguiente trabajo: GENOTOXICITY OF A THIOSULFONATE COMPOUND DERIVED FROM ALLIUM sp.• INTENDED TO BE USED IN ACTIVE FOOD PACKAGING: IN VIVO COMET ASSAYAND MICRONUCLEUS TEST. (Mellado-García y cols., 2016), Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 800-801, 1-11. Se procedió al estudio de la genotoxicidad mediante el ensayo de MN en la sangre de la médula ósea de las ratas Wistar, así como el ensayo cometa en estómago e hígado de las mismas, por ser el primer órgano de contacto en la ingestión de PTSO y el principal órgano de metabolismo de xenobióticos, respectivamente. Este estudio fue realizado administrando a las ratas dosis de 55; 17,4; 5,5 mg/kg p.c. de PTSO. Tras la necropsia, se realizó un estudio histopatológico de ambos órganos, no observándose indicios de genotoxicidad al microscopio óptico ni al microscopio electrónico en las ratas expuestas respecto del control. Solamente, a la concentración más alta ensayada se observó un incremento del almacenamiento de glucógeno en hígado y procesos degenerativos en estómago con vacuolización de las membranas celulares. El estudio se completó con un análisis para determinar la presencia de PTSO mediante cromatografía UHPLC-MS/MS Orbitrap en la sangre de las ratas tratadas, no detectándose PTSO en ningún caso. Por último, para corroborar la ausencia de genotoxicidad en los órganos estudiados previamente, se decidió evaluar la presencia de PTSO en los tejidos empleando la técnica de pirólisis analítica mediante cromatografía gaseosa combinada con un detector de masas (Py-GC-MS). Se demostró la existencia en hígado de derivados del componente principal y dos posibles metabolitos, lo que confirmó el fenómeno de metabolismo de PTSO en el organismo. Tras el estudio de toxicidad aguda de PTSO en ratas, de nuevo siguiendo las recomendaciones de la EFSA (EFSA, 2011), con el fin de completar los resultados de genotoxicidad obtenidos, y dada la escasez de información in vivo, se realizó un ensayo de toxicidad crónica durante 90 días con PROALLIUM AP®. TOXICOLOGICAL EVALUATION OF AN ALLIUM-BASED COMMERCIAL• PRODUCT IN A 90-DAY FEEDING STUDY IN SPRAGUE-DAWLEY RATS. (Mellado-García y cols., 2015), Food and Chemical Toxicology 90, 18-29. El PROALLIUM AP® es un extracto de diferentes componentes presentes en Allium sp. que será incorporado en los films anteriormente mencionados por su actividad antimicrobiana. En este sentido, tras la realización de los ensayos anteriores, debido a la falta de información de este componente y siguiendo las recomendaciones del Comité Científico en alimentación de la Unión Europea, el cual requiere la evaluación de las sustancias usadas en materiales en contacto con alimentos, se realizó un estudio de toxicidad subcrónica oral en ratas Sprague-Dawley por un periodo de exposición por vía oral de 90 días. Para ello se emplearon dosis de 0, 25, 100 y 400 mg/kg/día PROALLIUM AP®. Las ratas fueron sacrificadas y se extrajeron sus órganos (hígado, riñón, intestino, cerebro, timo, epidídimo, glándula adrenal, corazón, testículos/ovarios, pulmones y bazo) y sangre por punción cardíaca. Adicionalmente, las ratas fueron controladas cada semana midiendo el peso, el consumo de agua y comida, y se añadió un estudio histopatológico, bioquímico clínico y hematológico de las ratas expuestas. Las ratas no mostraron signos clínicos de mortalidad dosis-relacionados. Los resultados no mostraron diferencias significativas a ninguna de las concentraciones expuestas respecto del control, en ninguno de los parámetros estudiados. De esta forma, se determinó el NOAEL de PROALLIUM AP® en 400 mg/kg/día, un valor 500 veces superior al de la exposición derivada de su potencial uso en envase activo. Además con el fin de estudiar otro componente OS con potencial aplicación en la industria alimentaria, PTS, al cual se le atribuyen también propiedades antimicrobianas, se realizó la evaluación de la citotoxicidad, mutagenicidad y genotoxicidad in vitro del mismo, en la siguiente publicación: IN VITRO TOXICOLOGICAL ASSESSMENT OF AN ORGANOSULFUR COMPOUND FROM ALLIUM EXTRACT: CYTOTOXICITY, MUTAGENICITY AND GENOTOXICITY STUDIES. (Mellado-García y cols., 2017), Food and Chemical Toxicology 90, 231–240. El objetivo de este estudio fue la realización por primera vez del estudio de la citotoxicidad de PTS en células Caco-2 a 24 y a 48h, determinando su CE50 (280 μM) a través de distintos biomarcadores de viabilidad (RN, MTS, CP). Además se realizó una evaluación de la mutagenicidad en el test de Ames (0-280 μM), en el cual se utilizaron 5 cepas de S. typhimurium. En este ensayo, no se observaron diferencias significativas a ninguna de las concentraciones ensayadas, en presencia o en ausencia de S9. Por otro lado, en el ensayo de MLA, no se observaron diferencias significativas en el ensayo ni tras 4 ni 24h de exposición, demostrando así la ausencia de mutagenicidad. Además de estos ensayos, se realizó una evaluación de la genotoxicidad mediante el test de MN en las células L5178Y TK+/- tanto en ausencia (0-17,25 μM) como en presencia (0-25 μM) de S9. En este ensayo, se detectó un aumento de la frecuencia de células binucleadas con MN a la concentración más elevada ensayada sin S9 (17,25 μM), y a las dos concentraciones más altas con S9 (20-25 μM), mostrando que tanto los metabolitos como el componente original producen genotoxicidad. Por último, se estudió la genotoxicidad mediante el ensayo cometa estándar (0-280 μM) y modificado con enzimas de restricción en células Caco-2. En este caso, solamente se observaron daños en el ADN a la concentración más alta ensayada en el ensayo cometa estándar, mientras que no se observaron daños oxidativos en el ensayo cometa modificado a ninguna concentración. Para concluir, para la realización de esta tesis doctoral, la doctoranda realizó una estancia internacional en el departamento de “SEBIO, Stress Environnementaux et Biosurveillance de milieux aquatiques” en la Universidad de Reims, Champagne-Ardennes, (Francia). Esta estancia se realizó bajo la dirección del Doctor Stéphane Bettoulle, el Doctor Alain Geffard como director del departamento y con la colaboración y supervisión del doctorando Hakim Samai. Tras los resultados obtenidos previamente in vitro, sobre distintos tipos celulares, unidos a los ya realizados anteriormente por nuestro laboratorio sobre PTSO, se decidió aprovechar esta estancia internacional para estudiar la mortalidad celular de las células THP-1 (leucemia monocítica aguda), en estado macrófago, así como el estrés oxidativo y la fagocitosis en la exposición de diferentes concentraciones de PTSOdurante 24h mediante citometría de flujo. Los resultados obtenidos de este experimento dieron lugar a la siguiente publicación: • “DETERMINACIÓN DE LA MORTALIDAD CELULAR, ESTRÉS OXIDATIVO Y FAGOCITOSIS EN MACRÓFAGOS DE CÉLULAS THP-1 MEDIANTE CITOMETRÍA DE FLUJO”, Revista Española de Toxicología (pendiente de publicación). En este ensayo se estudió el comportamiento de PTSO en las células THP-1, células de leucemia monocítica humana midiendo la mortalidad celular, el estrés oxidativo y la fagocitosis mediante citometría de flujo. Para ello, las células THP-1 fueron activadas a estado macrófago, obteniéndose un aumento significativo de la mortalidad celular a partir de 60 μM de PTSO. Por otro lado, no se observaron aumentos significativos de la producción de especies reactivas de oxígeno a ninguna de las concentraciones de exposición. Por último, se estudió la fagocitosis utilizando microesferas fluorescentes de látex, que mostraron diferencias significativas a 60 μM de PTSO y a la concentración más alta ensayada (150 μM de PTSO). Además, se estudió la actividad fagocitaria de THP-1 dando como resultados diferencias significativas a 60 μM y a 150 μM. Por último, se determinó el número medio de microesferas fagocitadas por célula, obteniéndose diferencias significativas a las dos concentraciones más altas ensayadas respecto del control negativo (100 y 150 μM) siendo un total de 6 microesferas/célula. Teniendo en cuenta estos resultados, podríamos decir que las concentraciones que pueden llegar a producir efectos tóxicos in vitro son inferiores a las que se esperan puedan llegar al consumidor en el peor escenario posible (37.5 µM de PTSO).
- English
Currently, the food industry is betting on the incorporation of natural substances into food packaging in order to increase the durability of food in the market. These practices are intended to satisfy the needs of consumers so that their use entails technological advantages and benefits for the consumer. However, in order to admit a substance as an additive, it must be well characterized chemically and must overcome the toxicological assessment established by the corresponding health agencies, due to the lack of knowledge of the use of these components and their possible consequences. Among the natural substances used for this purpose are Essential Oils (EOs), which have traditionally been used for their pharmacological properties. In our case, both an extract of the genus Allium, commercially known as PROALLIUM AP®, as well as some of its components (PTSO and its analog PTS) are intended to be used as antimicrobials in the food industry as part of active packaging. As a preliminary step to the study of its safety, a bibliographical review of the toxicity data available so far was made in the scientific literature. Afterwards, the lack of studies required in different compounds with interest in food preservation and the disparity of available results have been evidenced. The toxicological evaluation carried our in the present Thesis started with a battery of tests both in vitro, with cells that would be in contact with these substances when ingested, and in vivo, in rats after acute and chronic consumption, in order to investigate possible toxic effects, mainly genotoxicity, which may be triggered upon exposure to PROALLIUM AP®, PTSO and PTS. Tre relevance of the toxicological information of these substances is essential for their future use since it is a regulatory requirement by the competent authorities prior to their commercialization. All these experiments has led to the following publications: GENOTOXICITY ASSESSMENT OF PROPYL THIOSULFINATE OXIDE, AN ORGANOSULFUR• COMPOUND FROM ALLIUM EXTRACT, INTENDED TO FOOD ACTIVE PACKAGING. (Mellado-García y cols., 2015), Food and Chemical Toxicology 86, 365-373. The most important route of exposure in our context is the oral route because once the PROALLIUM AP® extract is incorporated into films in active packaging, PTSO could be ingested by consumers. In this work, Caco-2 cells (colon adenocarcinoma) were exposed to different concentrations depending on the maximum concentration that would migrate from the film to the consumer in the worst possible scenario. Experiments carried out in our laboratory included the evaluation of the mutagenicity of PTSO in different strains of S. typhimurium (0-20 μM) each one with different genetically altered characteristics to present mutations in genes involved in histidine synthesis to cover a wide range of possible mutations. Mutagenicity in mammalian L5178Y TK +/- cells (MLA assay) was also studied following a previous cytotoxicity study, in which the exposure concentrations were determined at 4h (0-30 μM) and at 24h ( 0-20 μM). In the case of the Ames test, there were no significant differences in any of the strains studied in the absence or presence of S9. However, at 24 h of exposure in the MLA assay, significant differences were observed in the revertant colonies in the range of 2.5-20 μM. On the other hand, PTSO did not induce increases in the percentage of MN (0-40 μM) in the absence of S9 at any of the concentrations tested, but it did in the presence of the microsomal fraction S9 from 15 μM, indicating the genotoxicity of its metabolite. Finally, the comet assay (0-50 μM) showed that PTSO did not induce DNA strand breaks or oxidative damage in the DNA of Caco-2 cells exposed. Afterwards, considering the contradictory results of PTSO obtained in genotoxicity in vitro, following the recommendations of the EFSA (EFSA 2011), the in vivo genotoxicity of PTSO in Wistar rats was studied in the following work: GENOTOXICITY OF A THIOSULFONATE COMPOUND DERIVED FROM ALLIUM sp.• INTENDED TO BE USED IN ACTIVE FOOD PACKAGING: IN VIVO COMET ASSAY AND MICRONUCLEUS TEST. (Mellado-García y cols., 2016), Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 800-801, 1-11. Genotoxicity was studied by the MN test in the bone marrow in Wistar rats, and with the comet assay in stomach and liver of rats, being the first contact organ in the ingestion of PTSO and the main metabolism organ of xenobiotics, respectively. This study was performed by administering to the rats doses of 55; 17.4; 5.5 mg/kg b.w. of PTSO. After necropsy, a histopathological study of both organs was performed, with no evidence of genotoxicity under optical microscopy or electron microscopy in rats exposed to the control. Only at the highest concentration tested an increase in glycogen storage in liver and degenerative processes in the stomach with vacuolization of cell membranes were observed. The study was completed with an analysis to determine the presence of PTSO by UHPLC-MS/MS Orbitrap chromatography in the blood of treated rats, with no PTSO detected. Finally, in order to corroborate the absence of genotoxicity in the organs previously studied, the evaluation of the presence of PTSO in the tissues using the analytical pyrolysis technique by gas chromatography combined with a mass detector (Py-GC-MS) was carried out. It was demonstrated the existence in liver of derivatives of the main component and two possible metabolites, which confirmed the phenomenon of metabolism of PTSO in the organism. Following the acute toxicity study of PTSO in rats, and again following the recommendations of the EFSA (EFSA, 2011), in order to complete the results of genotoxicity obtained, and given the lack of in vivo information, a test of chronic toxicity for 90 days with PROALLIUM AP® was carried out. TOXICOLOGICAL EVALUATION OF AN ALLIUM-BASED COMMERCIAL PRODUCT IN• A 90-DAY FEEDING STUDY IN SPRAGUE-DAWLEY RATS. (Mellado-García y cols., 2015), Food and Chemical Toxicology 90, 18-29. PROALLIUM AP® is an extract of different components present in Allium sp. This extract will be incorporated into the films mentioned above for their antimicrobial activity. In this regard, following the previous tests, due to the lack of information on this component and following the recommendations of the Scientific Committee on Food of the European Union, which requires the evaluation of substances used in food contact materials. An oral subchronic toxicity study was performed on Sprague-Dawley rats for a 90-day oral exposure period. The doses: 0, 25, 100 and 400 mg/kg/day PROALLIUM AP® were used. Rats were sacrificed and their organs (liver, kidney, intestine, brain, thymus, epididymis, adrenal gland, heart, testicles/ovaries, lungs and spleen) and blood by cardiac puncture were extracted. In addition, rats were monitored weekly for weight, water and food consumption, and a histopathological, clinical and hematological study of the exposed rats was added. Rats showed no clinical signs of dose-related mortality. The results did not show significant differences at any of the concentrations exposed to the control, in any of the parameters studied. In this way, PROALLIUM AP® NOAEL was determined at 400 mg/kg/day, a value 500 times higher than exposure derived from its potential use in active packaging. In addition, in order to study another OS component with potential application in the food industry, PTS, to which antimicrobial properties are also attributed, its in vitro cytotoxicity, mutagenicity and genotoxicity evaluation were performed in the following publication: IN VITRO TOXICOLOGICAL ASSESSMENT OF AN ORGANOSULFUR COMPOUND• FROM ALLIUM EXTRACT: CYTOTOXICITY, MUTAGENICITY AND GENOTOXICITY STUDIES. (Mellado-García y cols., 2016), Food and Chemical Toxicology (in press) The objective of this study was to study for the first of cytotoxicity of PTS in Caco-2 cells at 24 and 48h, determining its CE50 (280 μM) through different biomarkers of viability (RN, MTS, CP). Moreover, an evaluation of the mutagenicity in the Ames test (0-280 μM) was carried out, in which 5 strains of S. typhimurium were used. In this test, no significant differences were observed at any of the concentrations tested, in the presence or absence of S9. On the other hand, in the MLA assay, no significant differences were observed in the assay either after 4 or 24 hours of exposure, thus demonstrating the absence of mutagenicity. In addition to these assays, an assessment of genotoxicity was performed by the MN test on L5178Y TK+/- cells both in the absence (0-17.25 μM) and in the presence (0-25 μM) of S9. In this assay, an increase in the frequency of binucleated cells with MN at the highest concentration tested without S9 (17.25 μM) was detected, and at the two highest concentrations with S9 (20-25 μM), showing that the metabolites as well as the original component produce genotoxicity. Finally, genotoxicity was studied using the standard comet assay (0-280 μM) and modified with restriction enzymes in Caco-2 cells. In this case, only DNA damage at the highest concentration tested in the standard comet assay was observed, whereas no oxidative damage was observed in the modified comet assay at any concentration. For the accomplishment of this doctoral thesis, the Phd student realized an international stay in the department of "SEBIO, Stress Environnementaux et Biosurveillance de milieux aquatiques" in the University of Reims, Champagne-Ardennes, (France). This stay was conducted under the direction of Dr. Stéphane Bettoulle and Alain Geffard (department director) and with the collaboration and supervision of Dr. Hakim Samai. • "DETERMINATION OF CELL MORTALITY, OXIDATIVE STRESS AND PHAGOCYTOSIS IN THP-1 CELL MACROPHAGES BY FLOW CYTOMETRY", Revista Española de Toxicología (pending publication). In this work, the behavior of PTSO in THP-1 cells, human monocytic leukemia cells, was studied by means of cell death, oxidative stress and phagocytosis activity by flow cytometry. For this purpose, THP-1 cells were activated into a macrophage state, resulting in a significant increase in cell death from 60 μM PTSO. On the other hand, no significant production of reactive oxygen species was observed at any concentration. Finally, phagocytosis activity was studied using fluorescent latex microspheres, which showed significant differences at 60 μM of PTSO and the highest concentration tested (150 μM PTSO). The mean number of microspheres phagocytosed per cell was determined, with significant differences obtained at the two highest concentrations tested against the negative control (100 and 150 μM) for a total of 6 microspheres/cell. Taking into account these results, we could say that the concentrations that can produce toxic effects in vitro in lymphocytic cells are lower than those expected to reach the consumer in the worst case scenario (37.5 μM PTSO).
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