Identificación y cuantificación de Clostridium tyrobutyricum por PCR a tiempo real en muestras de leche

• LÓPEZ-ENRÍQUEZ, L. ^[1] ; VELASCO-MARTÍN, V. ^[1] ; PRIETO-SAEZ, J. ^[1] ; Galván-romo, J.l. ^[1] ; Hernández, M. ^[1]
  1. [1] Instituto Tecnológico Agrario de Castilla y León

     Instituto Tecnológico Agrario de Castilla y León

     León, España

     
• Localización: XXXI Jornadas Científicas y X Internacionales de la Sociedad Española de Ovinotecnia y Caprinotecnia (SEOC): Zamora, 20-22 de septiembre de 2006 / coord. por Luis Fernando de la Fuente Crespo, Mariano Herrera García, José Alfonso Abecia Martínez, María Jesús Alcalde Aldea, María Dolores Carro, Juan Francisco García Marín, Carlos Gonzalo Abascal, Valentín Pérez Pérez, Cristòfol Peris Ribera, Luis Anel Rodríguez, Luis Antonio Rodríguez Ruiz, 2006, ISBN 84-934535-8-7, págs. 103-105
• Idioma: español
• Títulos paralelos:
  • A novel real-time PCR method for the identification and quantification of Clostridium tyrobutyricum in milk samples
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• Resumen
  • español

    La identificación y cuantificación de microorganismos por técnicas de biología molecular, particularmente la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a tiempo real, está siendo ampliamente empleada hoy día. Sin embargo, no existe un método de PCR a tiempo a real que permita la enumeración del microorganismo alterante Clostridium tyrobutyricum. Esta bacteria es la principal responsable de la hinchazón tardía en quesos curados y semicurados. En este trabajo hemos optimizado un protocolo para la extracción de ADN microbiano a partir de leche, y hemos desarrollado un método de PCR a tiempo real que permite la detección cuantitativa de C. tyrobutyricum. El sistema de PCR amplifica una región del gen flagellin (fla) e incluye un control interno de amplificación (IAC). La coamplificación del IAC en formato de PCR duplex permite descartar falsos negativos que se producen con frecuencia debido al efecto inhibitorio que producen ciertos compuestos de la leche. El ensayo mostró ser 100% específico, como se pudo comprobar utilizando 19 aislados de Clostridium y 40 especies que no eran del género. Asimismo, la cuantificación del número de esporas por el método nuevo de PCR a tiempo real se comparó con el recuento de esporas por la técnica del número más probable (NMP) en muestras de leche.

  • English

    Detection and quantification of microorganisms by molecular techniques, particularly PCR, is being widely used in microbiological diagnosis. However, a method for the enumeration of the spoiling microorganism Clostridium tyrobutyricum is not currently available. This bacterium is the principal responsible for the late-blowing in hard and semi-hard cheeses. In this study, we have optimised a specific microbial DNA purification procedure from milk. We have also developed and assessed a realtime PCR assay, for the species-specific quantitative detection of C. tyrobutyricum. The PCR target was a region of the flagellin (fla) gene and the PCR system included an Internal Amplification Control (IAC). The co-amplification of the IAC in duplex PCR format enabled us to determine false negative results, quite common due to the high inhibitory effect of certain compounds of milk. The assay coprovedto be 100% specific, as determined with 19 Clostridium isolates and 40 non-Clostridium strains, and highly sensitive. Moreover, the correspondence between the numbers of clostridia estimated by the PCR system compared with the number of spores/mL calculated by the Most Probable Number (MPN) was evaluated.