Resumen de Caracterización fenotípica y genotípica de "Listeria monocytogenes"

Beatriz Manso González, Beatriz Melero Gil, Jordi Rovira Carballido, David Rodríguez Lázaro

• español

  Listeria monocytogenes es una bacteria Gram positiva, y patógena que causa infecciones tanto en animales como en humanos. Tiene una gran capacidad de adaptación a diferentes condiciones ambientales lo que la hace muy resistente y difícil de eliminar en las industrias alimentarias. La gravedad de la infección que produce hace que sea necesario un conocimiento profundo de las características de las cepas que aparecen en la cadena alimentaria y en los alimentos. Por tanto, el objetivo de este trabajo es la caracterización genotípica y fenotípica de L. monocytogenes ayudando a las empresas en su control. En esta tesis caracterizaremos cepas de L. monocytogenes aisladas de diferentes industrias alimentarias: 176 de una industria cárnica, 45 de una láctea y 26 de una de marisco tanto de producto final como de muestras ambientales. En la caracterización genotípica hemos empleado herramientas de biología molecular para la identificación y clasificación de genes por diferentes métodos de PCR: PCR a tiempo real, PCR convencional y electroforesis, Stress Survival Islet-1, Tn 6188 (radC, quacH) y bcrABC; También hemos tipificado mediante PFGE (Pulse-field gel electrophoresis), MLST (Multi-Locus sequence typing) y MvLST (Multi virulence locus sequence typing). También queremos comprobar la expresión del transcriptoma en situaciones de estrés. Para la caracterización fenotípica hicimos: curvas de crecimiento; test de resistencia / tolerancia a detergentes y desinfectantes y experimentos de estrés. Se complementarán con estudios de resistencia a antibióticos, cultivo celular y estudios in vitro en diferentes matrices alimentarias. Comprobando por PCR a tiempo real la identificación de las cepas como L. monocytogenes, posteriormente se clasificaron en función del serotipo. De las 176 colonias aisladas en la industria cárnica un 27,84 % se englobaron dentro del serogrupo 1/2a, 3a; 68,75 % en el serogrupo 1/2c, 3c; 1,14 % en 1/2b, 3b, 7 y 2,27 % en 4b, 4d, 4e. Los 45 aislados de la quesería se clasificaron como: 72,73 % en el serotipo 1/2a, 3a; 11,36 % en el serotipo 1/2b, 3b, 7; 11,36 % en 4b, 4d, 4e y 4,55 % en 1/2c, 3c. Uno de los aislados se englobó dentro un serotipo mixto. Los aislados procedentes de los productos de marisco se clasifica- ron: 92,31 % en el serotipo 1/2a, 3a y un 7,69 % en el serotipo 4b,4d,4e. A partir del PFGE, se obtuvieron 13 pulsotipos diferentes en la industria cárnica, 7 pulsotipos en la industria láctea y únicamente 2 en la de marisco. Con en el MLST se obtuvieron 8 perfiles diferentes en la industria cárnica, 7 en la industria láctea y 2 en la empresa de marisco. Las curvas de crecimiento muestran un comportamiento prácticamente similar en todas las cepas. En el test de resistencia / tolerancia a desinfectantes y detergentes, la mayoría de las cepas fueron tolerantes a los detergentes empleados y sensibles a elevadas concentraciones del desinfectante. Actualmente estamos realizando los experimentos de estrés oxidativo. El resto de experimentos citados pero de los que no se muestran resultados es debido a que son estudios planificados para ser desarrollados en un futuro, una vez optimizado los protocolos adecuados.

• English

  Listeria monocytogenes is a Gram-positive and food-borne pathogen that causes infections in animals and humans. L. monocytogenes is able to survive in different environments of food industry so, it is very difficult to remove from plants. Due to the severity of listeriosis is important to go in-depth on the characteristics of the strains that appear in along the food chain and food products. The aim of this study is to characterize L. monocytogenes strains with genotyping and phenotyping methods for helping the industries to prevent the pathogen in food industry. During this PhD thesis, L. monocytogenes strains from different food industries will be characterized: 176 from a slaughterhouse, 45 from a cheese factory and 26 from a shrimps company. All of them have been isolated from environmental and final product samples. For genotyping characterization molecular biology tools, such as PCR methods will be used to identify and classify different genes of L. monocytogenes: real time PCR, conventional PCR and electrophoresis, stress survival islet- 1, Tn 6188 (radC, quacH) and bcrABC. Moreover, PFGE (Pulse-field gel electrophoresis), MLST (Multi-Locus sequence typing) and MvLST (Multi virulence locus sequence typing) will be used to perform strains typification. Furthermore, a better knowledge about transcriptome expressions in stress situations is necessary. Thus, for phenotyping characterization different experiments will be performed, such as growth curves, test of resistance / tolerance to detergent / disinfectant, stress oxidative, antibiotic resistances, cell culture and in vitro studies in different food products. The presumptive L. monocytogenes colonies ffrom the different samples were identified by real-time PCR and then classified by their serogroups. From 176 isolates in slaughterhouse, 27.84% belonged to 1/2a; 3a serotype; 68.75 % to 1/2c, 3c serotype; 1.14 % to 1/2b, 3b, 7 serotype and 2.27 % to 4b,4c,4e serotype. The 45 isolates from the cheese factory were classified as follows: 72.73 % in 1/2a, 3a serotype; 11.36 % in 1/2b, 3b, 7 serotype; 11.36 % in 4b, 4d, 4e serotype and 4.55 % in 1/2c, 3c serotype. One of them was a mixed serotype. Strains from the shrimps company were classified as follows: 92.31 % in 1/2a, 3a serotype and 7.69 % as 4b, 4d, 4e serotype. Thirteen different PFGE-types were obtained among the slaughterhouse strains, 7 PFGE-types among the cheese factory strains and only 2 in the case of shrimps company strains. Regarding MLST results, 8 different profiles were obtained from the slauthgerhouse strains, 7 profiles in the case of the cheese factory strains and 2 profiles among the shrimps company strains. With respect to phenotyping experiments, all of the tested strains presented similar growth curves. In addition, the majority of strains were sensitive to high concentration of disinfectant and had a better tolerance to the detergents tested. Oxidative stress studies are currently in process. The rest of the experiments listed will be planned further on when the protocols will be optimized.