Structural studies of Heteromeric Amino acid Transporters (HATs): Validation of the first 3D structural model of a HAT (human 4F2hc/LAT2) and identification of new HAT targets for 3D?crystallization

• Autores: María Elena Álvarez Marimón
• Directores de la Tesis: Albert Rosell Febres (dir. tes.), Manuel Palacín Prieto (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2014
• Idioma: inglés
• Tribunal Calificador de la Tesis: Robert Tampé (presid.), José Julio Chillarón Chaves (secret.), Alejandro Perálvarez Marín (voc.)
• Materias:
  • Química
    • Bioquímica
      • Aminoácidos
      • Biología molecular
      • Proteínas
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Dipòsit Digital de la UB
• Resumen

  • Los transportadores heteroméricos de aminoácidos (HAT) median el transporte de aminoácidos a través de la membrana plasmática. Están constituidos por dos subunidades unidas por un puente disulfuro. Los HATs se encuentran asociados a aminoacidurias, infección por virus, cáncer,¿ Por ello, eso el estudio de su estructura ayudaría en el diseño de fármacos. Las HAT son, moléculas difíciles de cristalizar y para las que no se han obtenido aún estructuras a nivel atómico, solamente, del ectodominio de 4F2hc. Por ello, la tesis tiene como objetivos: en primer lugar validando el primer modelo 3D a baja resolución de un HAT humano (4F2hc/LAT2), mediante experimentos de crosslinking, y, en segundo lugar, en la identificación de nuevas dianas que pudieses facilitar la cristalización tridimensional del heterodímero. Para ello se seleccionaron 24 subunidades ligeras de distintas especies eucariotas y se testaron en un proceso de selección para determinar el/los mejores candidatos para futuros estudios de cristalización 3D. El primer objetivo de la tesis finalizó con la determinación de residuos concretos de 4F2hc y de LAT2 cercanos en una distancia de 3-14 Å mediante la utilización de crosslinkings de cisteínas. Finalmente, tres líneas distintas: el modelo 3D obtenido por microscopía electrónica de transmisión y tinción negativa de partículas individuales (en colaboración con Dr. Fotiadis), los experimentos de crosslinking, y el docking generado en colaboración con Dr. Fdz-Recio, demostraron que 4F2hc-ED cubre, casi completamente, la superficie extracelular de LAT2. Además, 4F2hc estabiliza LAT2, y, en particular el ectodominio. Como resultados del segundo objetivo, tres subunidades ligeras de Xenopus fueron seleccionadas, tras adaptar el protocolo desarrollado por Drew et al.,2008, como mejores candidatas para estudios de cristalización 3D: LAT1, LAT2 y b0,+AT (siendo esta última la mejor candidata). Por ello, distintas estrategias se siguieron para mejorar la estabilidad de b0,+AT: eliminación de la cisteína reactiva, adición de lípidos a la muestra, cambio de sistema de expresión para aumentar su expresión a células de insecto Sf9. Además se generaron mutantes delecionados en N y C terminal para reducir su flexibilidad y aumentar la probabilidad de cristalización. Se concluye que b0,+AT (Xenopus tropicalis) es un buen candidato para estudios de cristalización.