Resumen de Nuevas estrategias miniaturizadas basadas en inmunoanálisis electroquímico soportado sobre partículas magnéticas para la detección y el control de la micotoxina Zearalenona
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En este trabajo de Tesis se ha llevado a cabo el desarrollo de diversas estrategias analíticas, basadas en inmunoanálisis electroquímico, aplicadas a la identificación y control de una micotoxina (zearalenona) en muestras alimentarias. Estas metodologías se erigen como una importante y competitiva alternativa a las técnicas clásicas que suelen hacer uso de instrumentación cara y sofisticada.
En los últimos años, los métodos inmunoanalíticos se han establecido como la metodología de elección para la determinación de micotoxinas en general, y de ZEA en particular, gracias a las excelentes características que ofrecen. Entre ellas, destacan su elevada especificidad, sensibilidad, relativa rapidez, sencillez y bajo coste.
Por otra parte, la detección electroquímica (ED) se configura como una valiosa herramienta debido a su alta sensibilidad, fácil utilización y costes relativamente bajos. Además, en el caso de los métodos inmunoanalíticos, es una herramienta idónea debido a la gran cantidad de marcadores (enzimas y moléculas electroactivas) y al buen comportamiento de las reacciones enzimáticas acopladas con reacciones de transferencia de carga. Es sin embargo, en el campo de la miniaturización y de los sistemas microfluidicos, donde la detección electroquímica demuestra claramente un gran potencial y aparece como la más importante alternativa a la detección óptica, debido a su miniaturización inherente sin pérdida importante de sensibilidad y, sobre todo debido a su compatibilidad con las técnicas de microfabricación.
El analito elegido, zearalenona (ZEA), es una micotoxina no esteroidea con actividad estrogénica producida por varias especies del género Fusarium. Esta micotoxina aparece en la mayoría de los cereales de grano pequeño y, en los últimos años, ha sido objeto de gran atención debido a los efectos adversos que supone tanto para la salud humana como animal. La cantidad máxima permitida de ZEA, tanto en alimentos destinados al consumo humano como para animales, varía de unos países a otros siendo 20 μg Kg-1 (ppb) el límite más restrictivo aplicado a alimentos infantiles. Debido a la toxicidad que conlleva su presencia en matrices alimentarias, su detección se ha convertido en uno de los campos más importantes dentro del análisis de alimentos. Además, teniendo en cuenta los bajos niveles de concentración a los que se encuentran las micotoxinas y con objeto de mejorar su regulación y control en alimentos, ha surgido la necesidad de desarrollar métodos cada vez más sensibles y específicos que permitan su adecuada determinación por debajo de los límites exigidos por la legislación.
El diseño de esta tesis tiene como punto de partida el desarrollo de un método ELISA convencional con detección electroquímica, a partir del cual se evoluciona de forma conceptual y natural hacia dos estrategias miniaturizadas situadas en la escena más contemporánea de la Química Analítica, la cual tiende a la simplificación, miniaturización y automatización de estos sistemas. Estas nuevas estrategias incluyen el desarrollo de un inmunosensor electroquímico sobre electrodos serigrafiados de carbono desechables y la integración total del ELISA electroquímico en una plataforma microfluídica.
La aproximación fundamental se basa en el desarrollo de un método ELISA convencional en placa, acoplado a su detección electroquímica en la superficie de electrodos serigrafiados de carbono. El inmunoensayo se desarrolla en base a un esquema competitivo directo, en el que la micotoxina ZEA y el conjugado enzimático (ZEA-HRP) compiten por los sitios de unión del anticuerpo específico para ZEA. En este trabajo se han utilizado partículas magnéticas recubiertas de proteína G como soporte sólido que permite la inmovilización orientada del los anticuerpos anti-ZEA. Una vez que ha tenido lugar el reconocimiento molecular (reacción antígeno-anticuerpo), la determinación de ZEA se basa en la detección amperométrica de mediador electroquímico (benzoquinona), directamente relacionada con la actividad de la enzima (HRP) que ha quedado retenida por la interacción del conjugado enzimático con el anticuerpo.
Todos los parámetros y condiciones involucrados en esta metodología de partida fueron previamente optimizados, y constituyen la base de las siguientes estrategias. Asimismo, se ha llevado a cabo la evaluación del método bajo el marco de la legislación vigente tomando como referencia las dos propiedades analíticas que hacen válida a dicha estrategia para el control de seguridad en alimentos: el límite de detección (LOD) y la exactitud. Los resultados obtenidos pueden considerarse excelentes, tanto respecto al límite de detección, comparable con el mejor descrito en la literatura, así como la exactitud, evaluada frente a un material de referencia certificado (MRC); en ambos casos, demostrando el potencial del sistema propuesto como una herramienta valiosa para la detección sensible de ZEA en alimentos infantiles. Estos resultados fueron refrendados mediante el análisis de dos muestras reales y representativas, correspondientes a alimentos infantiles que contienen cereales y de diversa complejidad, tales como un batido de leche y una papilla en polvo.
A partir de esta exitosa metodología de partida y teniendo en cuenta las extraordinarias propiedades que ofrece la tecnología de biosensores, la siguiente aproximación se centró en el desarrollo de un inmunosensor electroquímico soportado sobre partículas magnéticas y que hace uso de electrodos serigrafiados de carbono desechables. La transferencia de la metodología anteriormente desarrollada sobre la superficie de electrodos serigrafiados de carbono, permite la posibilidad de producir un sistema desechable y con la capacidad de llevar a cabo análisis in situ de forma sencilla. En este caso y una vez finalizada la reacción de bioreconocimiento, las partículas magnéticas sobre cuya superficie ha tenido lugar la formación de los correspondientes inmunocomplejos, son confinadas gracias a la ayuda de un imán, en la superficie de un electrodo serigrafiado de carbono para su detección electroquímica. Además de los beneficios inherentes a esta tecnología, se hace preciso destacar unos excelentes LOD y exactitud, similares a los obtenidos en la estrategia inicial.
Adicionalmente, y con fines de simplificar el tedioso protocolo de calibración que exige el trazado completo de la función logística log-logit de cuatro parámetros utilizada de forma habitual, se ha propuesto un protocolo de calibración simplificada. En este sentido, se puede llevar a cabo de manera secuencial la calibración y el análisis de ZEA, utilizando para ello el mismo electrodo serigrafiado de carbono. Se obtuvieron excelentes características analíticas en términos de exactitud y precisión, con un bajo error sistemático (inferior al 4%) y una excelente reproducibilidad (RSD = 6%). Esta estrategia refuerza los méritos analíticos del inmunosensor electroquímico convirtiéndole en una herramienta analítica desechable muy prometedora para realizar análisis in situ en muestras de alimentos.
La segunda estrategia miniaturizada que se ha explorado en esta Tesis, se basa en la combinación del inmunoanálisis electroquímico con plataformas microfluídicas. Esta estrategia hace uso de los beneficios aportados por los sistemas microfluídicos, tales como tiempos de análisis rápidos, la reducción del consumo de muestras y/o reactivos, la posibilidad de llevar a cabo análisis paralelos y de forma simultánea en un único dispositivo, a la vez de convertirse en una plataforma ideal para los microsistemas de análisis de inyección en flujo, ya que permite un control riguroso de los fluidos y por una tanto una mayor precisión en las distintas operaciones analíticas que configuran un microsistema de análisis total.
En un paso previo hacia la integración total del inmunoensayo electroquímico en una plataforma microfluídica, se ha desarrollado una estrategia inicial que permite la monitorización electroquímica “on-chip” del producto generado por la reacción enzimática correspondiente al método ELISA. Una vez tienen lugar las interacciones propias a un ELISA en pocillos individuales y “off-chip”, el producto enzimático es inyectado electrocinéticamente y conducido para su detección electroquímica “on-chip”. Con fines de conseguir una simplificación metodológica, se ha propuesto la utilización de los dos reservorios del chip para poder integrar las señales correspondientes a la calibración metodológica y el inmunoanálisis propiamente dicho, y así obtener la determinación de ZEA. A través de esta estrategia se han determinado fácilmente concentraciones inferiores a 1 ppb, lo que permite el control de ZEA muy por debajo de los límites máximos permitidos por la legislación para alimentos infantiles.
Finalmente, y atendiendo a lo que podría ser considerado el objetivo último de esta Tesis, se llevó a cabo la integración total de los diferentes pasos correspondientes al bioreconocimiento y a la detección electroquímica en un único y sencillo dispositivo microfluídico. Los beneficios derivados del uso de partículas magnéticas (aumento del área superficial, fácil manipulación para ejecutar las distintas etapas), así como de los microcanales (reducción del volumen de muestras y reactivos, disminución de las distancias de difusión para las interacciones biológicas) y de la detección electroquímica, provocan una gran mejora en la eficiencia del inmunoensayo.
Esta estrategia implica un uso elegante y creativo de un sencillo microchip con configuración de doble T, que permite realizar de forma secuencial tanto la inmunoreacción como la reacción enzimática dentro del propio dispositivo. Todo ello tiene lugar mediante la aplicación de una combinación de campos eléctricos a los diferentes reservorios para conducir los fluidos a las distintas zonas (canales) del chip y realizar las correspondientes reacciones.
Bajo estas condiciones de funcionamiento, el sistema ha demostrado su capacidad para determinar la micotoxina ZEA reduciendo el tiempo total de análisis a 15 minutos, evitando los pasos manuales en el procedimiento y utilizando sólo unos pocos nanolitros de reactivos. El límite de detección obtenido ha sido de 0,4 ppb, con un bajo error sistemático del 2% en el análisis de un material de referencia certificado de ZEA en maíz, así como unas excelentes recuperaciones comprendidas entre el 103 y 101% para el análisis de muestras reales de naturaleza sólida y líquida respectivamente.
- English
In the project of this Thesis, the mycotoxin ZEA has been chosen as the target analyte for the development of various analytical strategies, based on Electrochemical Immunoassay, to improve its identification and control in food samples. These analytical strategies intend to configure an alternative and competitive route to the existing ones, which employ expensive and sophisticated analytical instrumentation.
Immunoassays, mainly ELISA methods, have proven to be an excellent technology as sensitive, specific, without the need of extensive clean-up, rapid, simple and with a high throughput for the detection of different chemicals in a wide variety of food matrices including mycotoxin analysis.
Moreover, electrochemical detection (ED) is a valuable tool because of its high sensitivity, simplicity, suitability for mass-production and low cost. Besides, in immunoassays, ED is one of the most appropriated tools due to the large number of labels (enzymes and electroactive molecules) and the good behaviour of enzymatic reactions coupled to charge transfer reactions. Additionally, in the field of miniaturization and microfluidic systems, ED appears as a very suitable alternative to optical detection due to its inherent miniaturization and compatibility with microfabrication techniques without loss of performance.
By other hand, zearalenone (ZEA), a nonsteroidal oestrogenic mycotoxin produced by several species of Fusarium, can be found in different cereals and it has attracted recent attention because of the adverse effects on human and farm animal’s health. A maximum tolerable amount of 20 μg Kg-1 has been set in baby food. This fact has made mycotoxin analysis, and particularly ZEA monitorization, one of the most important fields of food analysis. The extremely low level of this mycotoxin requires from the development of new sensitive and specific methods for rapid detection of ZEA in food samples, below the current and forthcoming more restricted maximum tolerable amounts.
The design of this Thesis was configured from the initial development of a conventional ELISA methodology with electrochemical detection, towards new strategies situated in the more contemporary scene of the Analytical Chemistry comprising miniaturized, simplified and automatized systems. These new strategies include the development of an electrochemical immunosensor on screen-printed disposable platforms and a full-integrated electrochemical immunoassay into a lab-on-a-chip device.
The fundamental approach relays on common Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) performed in conventional microwells, and coupled to electrochemical detection accomplished on the surface of carbon screen-printed electrodes. Basically, the immunoassay procedure was developed on the basis of a competitive scheme, where the mycotoxin ZEA and an enzyme-labelled derivative compete for the binding sites of the specific antibody. Protein G covalently bound to magnetic particles acts as an oriented immobilization support for the capture of the anti-ZEA antibody. After the molecular recognition event takes places, the extent of the affinity reaction is evaluated by the sensitive detection of a redox mediator directly related to the activity of the enzyme tracer (Horseradish peroxidase-ZEA).
All parameters and conditions involved in this basic methodology were previously optimized, since they constitute the basis for the next and more relevant strategies. Evaluation of the analytical performance was mainly focused on the detection limit and accuracy. A remarkable detection limit, which is comparable with the best one described in the literature, and excellent accuracy, evaluated using a certified reference material (CRM), shows the potential of the proposed system as a valuable tool for the sensitive detection of ZEA in baby food. The applicability for real sample analysis was confirmed by the analysis of representative infant food samples containing cereals as a liquid milkshake and a powdered baby food.
From this successful starting methodology and taking in account the extraordinary properties offered by biosensors technology, the next approach was focused in the development of an electrochemical immunosensor based on the use of magnetic beads and disposable carbon screen printed electrodes (CSPE). Transfer of the previous developed methodology onto the surface of screen-printed electrodes, allows the possibility of producing a disposable and point-of-care analytical system. In this case, and after biological recognition, the immunocomplex-modified paramagnetic beads were confined on the surface of CSPE by the aid of a magnet, where electrochemical detection can be easily completed. Benefits of this portable methodology can be obtained, while keeping an excellent LOD and accuracy similar to the initial strategy. Additionally, and in order to diminish the time consuming and laborious procedure for routinely performing a four parameters logistic calibration curve, a simplified calibration protocol is also proposed. Sequential calibration and analysis of target mycotoxin, using just one disposable CSPE each, can be accomplished. Excellent analytical features in terms of accuracy and precision were again obtained with a remarkable low systematic error (less than 4%) and excellent reproducibility (RSD=6%). This strategy enhances the analytical merits of the electrochemical immunosensor as a very promising disposable analytical tool for in situ food-safety diagnosis.
The second option explored in this Thesis, lies with the combination of electrochemical immunoassays and microfluidic platforms. This strategy makes use of the benefits provided by microfluidic chips such as faster analysis times, extremely low sample and reagent volumes, parallelization of analysis into a small monolithic piece, together with being an ideal platform for performing microscale flow injection analysis with accurate fluid control and manipulation capabilities.
In a previous step towards the total integration of electrochemical immunoassay into a microfluidic platform, a relevant work has been performed for electrochemical monitorization on-chip of the enzymatically-generated product derived from the ELISA methodology. After immunoassay was performed off-chip in single ELISA microwells, the enzymatic product was electrokinetically injected and pumped for electrochemical detection on-chip. Simplified, fast and sequential analysis and calibration can be accomplished using a multiplexed format within the microfluidic chip. An extremely low sample concentration of less than 1 ppb was easily determined, allowing the control within regulatory limits of ZEA in baby foods.
The final option presented, which can be seen as the ultimate aim of this Thesis, deals with the full integration of the different steps regarding to biological recognition and electrochemical detection on a single microfluidic device. The multiple benefits derived from using magnetic microbeads (large available surface area, easy manipulation for different steps and reloading), micrometer-sized channels (less sample and reagents volumes, reduced diffusion length for biological interactions), and electrochemical detection, greatly improve the efficiency of the immunoassay.
This strategy implies the creative use of the simple channel layout of the double-T microchip to perform sequentially the immunointeraction and enzymatic reaction within the microchip. Applying a program of electric fields suitable connected to the reservoirs for driving the fluidics at different chambers, allows performing the different reactions. The system is able to determine the ZEA mycotoxin lowering the total immunoassay dedicated time (15 minutes), avoiding manual steps in the procedure and using only a few tens of nanoliters of reagents. Additionally, a suitable detection limit of 0.4 ppb, low systematic error of 2% from the analysis of the CRM and excellent recoveries of 103 and 101 % for solid and liquid samples respectively, were obtained.
