Cytokines and Cytokine-Receptors in the Pathogenesis of Alcoholic Hepatitis
- Autores: Silvia Affo
- Directores de la Tesis: Ramón Bataller Alberola (dir. tes.), Pau Sancho Bru (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2014
- Idioma: inglés
- Tribunal Calificador de la Tesis: Joan Clària (presid.), Montserrat Mari Garcia (secret.), Leo van Grunsven (voc.)
- Materias:
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- Tesis en acceso abierto en: TDX Dipòsit Digital de la UB
- Resumen
Título de la tesis: "Citoquinas y receptores de citoquinas en la patogenesis de la hepatitis alcohólica" (Cytokines and Cytokine-Receptors in the Patogenesis of Alcoholic Hepatits). El consumo de alcohol es una de las causas más importantes de mortalidad que pueden prevenirse en nuestro país. La hepatitis alcohólica (HA) se caracteriza por un proceso de inflamación hepática (fundamentalmente por infiltración de células polimorfonucleares), esteatosis masiva hepática, fibrosis pericelular y daño hepatocelular. La inflamación crónica del hígado debida a diferentes causas, induce un depósito progresivo de colágeno, denominado fibrosis hepática. Cuando la fibrosis es masiva, el paciente desarrolla una cirrosis hepática, que conlleva una elevada morbilidad y mortalidad. El desarrollo de complicaciones clínicas (ascitis, síndrome hepatorenal, encefalopatía hepática, hemorragia por varices esofágicas) se asocia con una supervivencia inferior a los 2 años y el único tratamiento curativo en estos pacientes es el transplante hepático. Desgraciadamente, el número de donantes es muy inferior al de pacientes que requieren un trasplante hepático, por lo tanto se requieren tratamientos que eviten la progresión de las hepatopatías crónicas a cirrosis. La mejor estrategia en estos enfermos hasta ahora es la eliminación del agente causal, la cual suele asociarse con una mejoría del daño hepático y frenando la progresión a cirrosis hepática. Sin embargo, la mayoría de pacientes alcohólicos no consiguen la abstinencia y no hay tratamientos efectivos para evitar la progresión a cirrosis o para evitar la evolución de la enfermedad. En los casos que la HA se produce en pacientes con cirrosis, su pronóstico es muy grave, los pacientes suelen desarrollar insuficiencia hepática, hipertensión portal y predisposición a infecciones bacterianas graves y conllevan una elevada mortalidad. En la actualidad no existen tratamientos efectivos para la HA, siendo necesaria la identificación de nuevas dianas terapéuticas. El único tratamiento de la HA que se ha mostrado efectivo son los corticosteroides, pero desgraciadamente, más de la mitad de pacientes no responden satisfactoriamente y dicho tratamiento no puede aplicarse a pacientes con infecciones bacterianas severas. Recientemente se han llevado a cabo estudios de la patogénesis de esta enfermedad, aunque con poco éxito. En particular, la administración de antagonistas de la citoquina TNF-alfa en pacientes con HA, aumentó su mortalidad debido a infecciones bacterianas. La base racional utilizada para la utilización de estos antagonistas estaba basada en estudios experimentales, a pesar de no tener información consistente de la patogenia de esta enfermedad en seres humanos. Debido a la falta de tratamientos efectivos, la HA continúa presentando un índice de mortalidad muy elevado en pacientes con hepatopatías crónicas. Por esta razón, existe una clara necesidad de identificar nuevas dianas terapéuticas para tratar a estos pacientes en los diferentes estadios de la enfermedad (esteatosis, inflamación y/o fibrogénesis). La realización de estudios traslacionales mediante el uso de muestras humanas es una estrategia de nuestro laboratorio para llevar a cabo este objetivo. El objetivo principal de esta tesis fue investigar nuevas dianas terapéuticas para el tratamiento de la HA. Para alcanzar dicho objetivo, realizamos estudios traslacionales in vitro e in vivo que permitieran identificar marcadores biológicos alterados en muestras humanas procedentes de hígados de pacientes con HA para estudiar la función que tienen en el desarrollo de la enfermedad y valorar si podrían considerarse como dianas terapéuticas. OBJETIVO ESTUDIO I. Mediante el abordaje traslacional identificar los biomarcadores candidatos a dianas terapéuticas a partir de muestras humanas de pacientes con HA. Objetivos específicos: I. Realizar un análisis del transcriptoma en pacientes con HA para identificar posibles nuevas dianas terapéuticas; II. Identificar las vías diferentemente reguladas y potencialmente implicados en la patogénesis de la HA; III. Analizar la vía de interacción "citoquinas-receptores de citoquinas¿ en diferentes tipos de enfermedades crónicas del hígado; IV. Explorar el papel del receptor de citoquinas Fn14 en la HA y sus correlaciones con las características clínicas de la enfermedad; V. Investigar los mecanismos que determinan la sobre-expresión de Fn14 en la HA. El primer estudio se publicó en la revista GUT (2012, Factor de Impacto 10.614) bajo el título de ¿Transcriptome analysis identifies TNF superfamily receptors as potential therapeutic targets in alcoholic hepatitis¿. En este estudio translacional, hemos identificado un perfil génico y de las vías que están diferentemente reguladas en pacientes con HA. Para hacerlo, realizamos un análisis del transcriptoma utilizando muestras de hígado obtenidas a partir de biopsias de pacientes con formas severas de HA. El análisis de la expresión génica, reveló 207 genes expresados de manera diferente y aumentados más de 5 veces en los pacientes con HA. Además, identificamos siete vías de señalización intracelular diferencialmente reguladas en pacientes con HA, entre ellas, la vía de ¿interacción citoquinas-receptores de citoquinas¿. Sorprendentemente, encontramos que varios miembros de la superfamilia de receptores de TNF (factor de necrosis tumoral) estaban aumentados en pacientes con HA y que en cambio, ninguno de los ligandos de la superfamilia de TNF se halló aumentado. Entre los receptores sobre-expresados en los hígados de pacientes con HA, Fn14 fue el único aumentado de manera exclusiva en pacientes con HA, en comparación con otras enfermedades hepáticas (esteatohepatitis no-alcohólica [NASH], virus C [VCH] y cirrosis compensada). Asimismo, la expresión génica de Fn14 correlacionó con importantes características clínicas de la enfermedad alcohólica, como la mortalidad a los 90 días y la gravedad de la hipertensión portal. Finalmente, la expresión hepática de Fn14 se estimuló en modelos experimentales de daño hepático agudo inducido por el etanol y acetaminofeno y en modelos experimentales de expansión de células progenitoras hepáticas. En último lugar, usamos cortes de hígado de alta precisión obtenidos a partir de hígados de ratones para investigar los mediadores que participan en la sobre expresión de Fn14 en el hígado dañado. Los cortes de hígado fueron expuestos a mediadores inflamatorios implicados en la patogénesis de HA (LPS y TNF-alfa), así como TWEAK (el ligando de Fn14) y TGFß1, un importante mediador de la fibrogenesis. La incubación de los cortes de hígado con LPS, TNF-alfa y TWEAK no aumentó la expresión génica Fn14, mientras TGFß1 fue el único mediador que aumentó la expresión de Fn14. En conclusión, la superfamilia de receptores de TNF y específicamente Fn14, podría representar una potencial diana terapéutica para el tratamiento de la HA. OBJETIVO ESTUDIO II. Estudiar el papel de la CCL20 en el daño hepático inducido por LPS y su papel potencial como mediador de la inflamación y de la fibrosis en la hepatitis alcohólica. Objetivos específicos: I. Estudiar los niveles génicos hepáticos y los niveles séricos de la quimiocina CCL20 en pacientes con HA y con otras enfermedades del hígado; II. Investigar las correlaciones de CCL20 con las principales características clínicas de la HA como el grado de fibrosis, la hipertensión portal, la endotoxemia y el reclutamiento de neutrófilos; III. Investigar la fuente celular de CCL20 en el hígado de animales con daño hepático de tipo agudo sobre crónico; IV. Investigar los efectos pro-inflamatorios y pro-fibrogénicos de CCL20 en células hepáticas estrelladas humanas; V. Estudiar los efectos del silenciamiento de CCL20 en modelos animales de daño hepático inducido por LPS. El segundo estudio se ha aceptado para publicar el 12 de Diciembre de 2013 en la revista GUT (2013, Factor de Impacto 10.732) bajo el título de ¿CCL20 mediates LPS-induced liver injury and is a potential driver of inflammation and fibrosis in alcoholic hepatitis¿. Gracias al primer estudio, identificamos los genes y las vías diferentemente reguladas en pacientes con HA. Dentro de la vía de interacción de citoquinas-receptores de citoquinas, la familia de quimiocinas CC presentó muchos genes regulados diferencialmente, entre ellos la quimiocina CCL20 se identificó como la más aumentada en pacientes con HA. Debido a que las quimiocinas juegan un papel importante en la fisiopatología de la HA, y que son mediadores importantes de la enfermedad, investigamos el papel de la CCL20 en la patogénesis de la HA con un estudio traslacional. Se evaluaron los niveles de expresión génica hepática y los niveles séricos de CCL20 en pacientes con HA y se demostró que ambos estaban aumentados en estos pacientes con respecto a controles sanos y con respecto a otras enfermedades hepáticas como NASH, VCH y cirrosis compensada. También se evaluaron las correlaciones de los niveles génicos y séricos de CCL20 con la gravedad de la enfermedad. Los niveles hepáticos y séricos de CCL20 se encontraron aumentados en pacientes con HA y correlacionaron con importantes parámetros clínicos que la definen como el grado de fibrosis, la hipertensión portal, la endotoxemia, la infiltración de neutrófilos hepática, y la mortalidad a corto plazo. La fuente celular de CCL20 y sus efectos biológicos se evaluaron in vitro e in vivo en modelos experimentales de daño hepático agudo, crónico y agudo-sobre-crónico, inducidos por lipopolisacárido (LPS) o etanol, tetracloruro de carbono (CCl4) y una combinación de CCl4 y LPS o etanol respectivamente. La expresión de CCL20 se encontró extremadamente aumentada en modelos animales con daño hepático de tipo agudo (inducido por LPS) y agudo-sobre-crónico (inducido por CCl4+LPS) que incluyen dos de las características principales observadas en pacientes con HA (fibrosis y endotoxemia). En el modelo de daño hepático agudo-sobre-crónico, identificamos a los macrófagos y a las células estrelladas hepáticas activadas como los tipos celulares que más producen CCL20 en el hígado dañado. Finalmente, decidimos investigar los efectos de la CCL20 en el daño hepático inducido por LPS, uno de los mayores agentes desencadenantes de respuestas pro-inflamatorias y pro-fibrogénicas en la enfermedad alcohólica. Por eso utilizamos una tecnología de interferencia de ARN in vivo y silenciamos CCL20 en modelos animales de daño hepático inducido por LPS. El silenciamiento de la CCL20 in vivo redujo el daño hepatocelular observado por la disminución de AST, ALT y LDH séricos y disminución de la activación de las caspasas 3 y 8 en el tejido hepático. Silenciando CCL20 también se produjo una disminución de moléculas pro-inflamatorias y pro-fibrogénicas hepáticas y un menor reclutamiento hepático de macrófagos y neutrófilos. Además, utilizando experimentos in vitro, observamos que la CCL20 indujo efectos pro-inflamatorios y pro-fibrogénicos en células estrelladas humanas en cultivo. Estos resultados sugieren que el aumento de la CCL20 está asociado con los niveles de LPS y con la endotoxemia y puede representan no sólo un nuevo biomarcador para predecir la mortalidad en pacientes con HA, sino también un importante mediador del daño hepatocelular y de la inflamación y fibrosis hepática. Por lo tanto, la CCL20 representa una diana terapéutica potencial para el tratamiento de la HA.
