Resumen de P-Glycoprotein functional activity in peripheral blood lymphocytes. Role of immunosuppressants, pharmacogenomics and alloimmune response
Inés Llaudó Vallmajor
En la nefropatía crónica del aloinjerto renal (NCT) se implican factores aloinmunes y no aloinmunes tales como la aloreactividad donante específica, inflamación crónica y nefrotoxicidad inducida por los anticalcineurínicos. La nefrotoxicidad varía en función de la combinación de los inmunosupresores. Así mismo, el diferente grado de nefrotoxicidad podría estar relacionado con el grado de inhibición de las diferentes proteínas transportadoras (MDR1, MRP1 y MRP2) que son las responsables de afluir el fármaco hacia el exterior de las células. Considerando la importancia del papel de éstas proteínas, las diferentes variantes genéticas de los genes que las codifican y su función, pueden afectar a la variabilidad interindividual con sus consecuencias en la farmacocinética de muchos fármacos. La monitorización del genotipo de los genes MDR1, MRP1 y MRP2, así como también su función, podría predecir la dosis óptima de los inmunosupresores en receptores de trasplante renal y la dosis inicial que necesita cada paciente individual para obtener la inmunosupresión adecuada. Los polimorfismos de estos genes están relacionados con la exposición al fármaco, la nefrotoxicidad y el rechazo. Estas proteínas también se asocian a factores inmunológicos. Tanto MDR1 como MRP1 juegan un papel importante en la activación de la célula T y también en la diferenciación y maduración de la célula dendrítica. El papel de estas proteínas transportadoras va más allá de una bomba de extrusión ya que se conoce que participan en la respuesta inmune siendo una nueva diana terapéutica para la inmunosupresión. El principal objetivo fue estudiar el rol de la P-Glicoproteína (MDR1/Pgp) tanto como una bomba transportadora de fármacos como su contribución en la farmacocinética y farmacogenética de los inmunosupresores. También se estudió el rol de Pgp en la respuesta aloinmune. En un primer estudio, se comparó la expresión de Pgp y la actividad de eflujo mediante el ensayo de Rodamina (Rho123) en linfocitos de voluntarios sanos guardados en diferentes condiciones para evaluar la influencia que podían tener estas condiciones de almacenaje sobre la expresión y funcionalidad de Pgp. Las estrategias para optimizar al máximo la sensibilidad y reproducibilidad de los ensayos de Pgp, son necesarias para cualquier estudio de actividad de Pgp, principalmente en estudios multi-céntricos. Se puso a punto un método para la medida de actividad de Pgp en linfocitos T, para poder ser aplicada en muestras de linfocitos de pacientes trasplantados renales. Se aislaron linfocitos de la sangre de 12 voluntarios sanos y se evaluó las diferencias de expresión de Pgp a nivel de RNA y proteína, entre linfocitos procesados y guardados en diferentes condiciones de almacenaje. Así mismo también se analizaron las diferencias de actividad de Pgp. Se definieron 4 grupos: 1) Linfocitos de sangre acabada de extraer (F/NFr); 2) Linfocitos de sangre acabada de extraer y inmediatamente congelados (F/Fr); 3) Sangre extraída 24h antes del ensayo de actividad y a RT (NF/NFr); 4) Sangre extraída 24h antes del ensayo de actividad y congelados (NF/Fr). No se encontraron diferencias significativas ni a nivel de expresión de mRNA ni a nivel de proteína cuando se compararon las cuatro condiciones de almacenaje. Mediante citometría de eflujo, las cuatro condiciones presentaban un perfil de retención de Rho123 muy similar, tanto en presencia como en ausencia de los inhibidores específicos de Pgp (Verapamil y PSC833). La población de células viables CD3+, presentaba mayor actividad de Pgp que la población de células apoptóticas (p<0,05). La población apoptótica no presentaba diferencias significativas cuando se comparaban las cuatro condiciones. Por el contrario, se observó una elevada variabilidad en la actividad de Pgp cuando se comparaba un mismo individuo por cada una de las diferentes condiciones. La población de células apoptóticas y necróticas representaban una población muy minoritaria, pero no se tuvieron en cuenta para estudiar la actividad de Pgp ya que podían interferir en los resultados. En un segundo objetivo se analizó la asociación de diferentes polimorfismos (SNPs) de Pgp/ABCB1 (C3435T, C1236T, G2677T i T129C) con la actividad de Pgp y la exposición a diferentes fármacos inmunosupresores en 70 pacientes de trasplante renal de diferentes hospitales. El tratamiento consistía en la inducción con daclizumab, micofenolato mofetil y corticosteroides junto con dosis bajas y estándar de CsA (n=30), tacrolimus (n=13) y rapamicina (n=23). Para el análisis farmacocinético se comparó la AUC0-12 de MPA y sus metabolitos en los diferentes grupos de tratamiento en cada punto de seguimiento. Se genotiparon todos los pacientes por los diferentes SNPs del gen ABCB1 y se estudió la actividad de Pgp en el conjunto de células en sangre periférica de los pacientes mediante el ensayo de Rho123. No se observaron diferencias significativas entre las variables demográficas (sexo y edad) ni en los parámetros bioquímicos (creatinina y albúmina). Mediante el análisis de haplotipos observamos una correlación positiva entre los tres SNPs del gen ABCB1 (C3435T-G2677T-C1236T). La actividad de Pgp se ve influenciada por estos 3 SNPs pero no por T129C. Los pacientes homocigotos para el alelo TT presentan menos actividad de Pgp que los no portadores (CT/CC). Los grupos de pacientes tratados con CsA presentaban menos actividad de Pgp que los grupos de macrólidos (Tac y Rapa) (P=0,04). Por otro lado, se clasificaron los genotipos según si eran high pumper (CT y CC) o low pumpers (TT) y se correlacionaron con la actividad de Pgp. Los pacientes high pumpers tratados tanto con CsA cómo con macrólidos presentaban más actividad de Pgp que los pacientes low pumpers (P<0,05) para los SNPs (C3435T-G2677T-C1236T). Sin embargo, los pacientes con el SNP T129C, los high pumper eran los heterocigotos para TT y presentaban un comportamiento contrario en cuanto a la expresión de Pgp en comparación con los otros tres SNPs. Considerando el grupo de riesgo, aquellos pacientes con un genotipo high pumer y baja dosis de CsA, se evaluó este grupo por separado. Los resultados muestran una correlación negativa entre CsA AUC y Cmin y actividad de Pgp al mes 1 post-trasplante. En un estudio in vivo donde se describe un modelo de nefrotoxicidad en ratas, se estudió el papel de Pgp en la asociación de Rapa (mTORi) con dos inhibidores de calcineurina (CsA y Tac). A partir de este trabajo, se realizó el siguiente estudio donde se analizó la actividad de Pgp in vitro en diferentes sub-poblaciones de célula T y los efectos de los mismos inmunosupresores solos y asociados con Rapa. Se analizó la retención de Rho123, el eflujo y cinética de extrusión en las poblaciones CD4+ y CD8+ en sangre periférica de voluntarios sanos. También se evaluó la respuesta antígeno-específica de memoria mediante el ensayo de proliferación y secreción de citoquinas en un cultivo linfocitario mixto. La acumulación intracelular de Rho123 disminuía significativamente en los grupos tratados con CsA y CsA+Rapa en comparación con el grupo no tratado y los otros inmunosupresores (Tac, Rapa y Tac+Rapa) tanto en la población CD4+ como en la CD8+. Por otro lado, la población CD8+ presentaba más acumulación intracelular de Rho123 que la CD4+. Los grupos tratados con CsA tienen un perfil de cinética de eflujo de Rho123 más lento en comparación con los otros grupos de tratamiento. Además, independientemente del tratamiento, la población CD4+ presentaba una extrusión más lenta y menor que las CD8+. Se observó una actividad de Pgp ligeramente menor en la población CD8+ respecto a la población CD4+. La tasa media de eflujo de los fármacos (t50) de la población CD8+ es más rápida que en las CD4+. Las dos sub-poblaciones mostraron más tiempo en extruir la CsA, tanto sola como asociada, respecto a los otros grupos. Esto reafirma el potente efector inhibidor de la CsA. Por otro lado, también se observó una inhibición de la proliferación de célula T tanto el grupo tratado con un inhibidor específico de Pgp (PSC833) como en los grupos tratados con los diferentes inmunosupresores. Globalmente, todos estos resultados evidencian la importancia que tiene la función de Pgp en los linfocitos y su implicación en cuanto a la exposición a fármacos inmunosupresores después del trasplante. El valor de la farmacogenómica y la farmacogenética en relación al rol de las ABC transporter y los fármacos inmunosupresores abre nuevos conocimientos que podrían influir directamente en la terapia inmunosupresora. Por último, la inhibición de P-Glicoproteína abre nuevas oportunidades como una posible nueva diana terapéutica para evitar el rechazo del injerto en trasplantes de órganos sólidos.
