Detección rápida de Mycobacterium tuberculosis complex y de la resistencia a los fármacos antituberculosos mediante métodos de amplificación genética e hibridación

• Autores: Raquel Moure González
• Directores de la Tesis: Fernando Alcaide Fernández de Vega (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2013
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Jordi Dorca (presid.), José Antonio Domínguez Benítez (secret.), Suzana Correia de Matos David (voc.)
• Calificación: Sobresaliente Cum Laude
• Materias:
  • Ciencias médicas
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en:  TDX  Dipòsit Digital de la UB 
• Resumen

  • El diagnóstico de la tuberculosis (TB) se basa en gran medida en métodos microbiológicos convencionales: a) un cribado mediante microscopía de bacilos ácido-alcohol resistentes que permite de forma rápida, sencilla y económica una primera orientación hacia el diagnóstico de TB en caso de que la baciloscopia sea positiva; y b) el cultivo de las muestras clínicas en medios específicos para micobacterias. El cultivo micobacteriano es el método considerado gold standard en el diagnóstico microbiológico de la TB, y además, permite obtener el aislamiento clínico con el que posteriormente se puede estudiar la sensibilidad a los fármacos antituberculosos o realizar análisis epidemiológicos. Sin embargo, estos métodos fenotípicos convencionales son insuficientes para un control eficaz de la tuberculosis, debido sobre todo a la baja sensibilidad de la microscopía y a la lentitud del cultivo micobacteriano. En este sentido se han desarrollado técnicas basadas en la amplificación genómica por PCR (polymerase chain reaction) y posterior estudio post-amplificación, fundamentalmente mediante hibridación en fase líquida o sólida, con sondas complementarias a los genes de interés, tanto para la detección del microorganismo como de su resistencia a los fármacos. En esta tesis se trata de evaluar, en un primer bloque, dos de los sistemas comerciales más recientes para el diagnóstico rápido de la TB. Uno de ellos es el sistema integrado de PCR a tiempo real, Xpert MTB/RIF (Cepheid, EEUU). Así se propuso determinar la eficacia de este sistema en casos de alta sospecha de tuberculosis y baciloscopia negativa, en nuestra área. En términos de sensibilidad se detectó un 78,2% de los casos de tuberculosis pulmonar y un 58,3% en los casos de tuberculosis extrapulmonar. Además, se determinó, en un estudio de rentabilidad potencial del uso en rutina de esta técnica, que el uso del Xpert MTB/RIF puede adelantar en una media de una semana el inicio del tratamiento antituberculoso, además de ahorrar recursos económicos en el diagnóstico (hasta 2000 euros). Por otro lado, la evaluación el sistema GenoQuick MTB (Hain LIfescience, Alemania) de PCR convencional y posterior hibridación rápida en fase sólida (lateral-flow dipstick), mostró a esta técnica como una alternativa a la previamente descrita al comprobarse que la sensibilidad obtenida en muestras con baciloscopia negativa fue de 78,1%, con una discreta mayor complejidad técnica pero también con un menor coste económico. Estos sistemas de PCR e hibridación se revelan como métodos muy útiles para la detección directa en muestra clínica de M. tuberculosis complex. Otro aspecto muy relevante, sobre el que también se ha investigado en los últimos años, es el de la detección de mutaciones genéticas implicadas en la resistencia a los principales fármacos antituberculosos. De esta forma se planteó, en un segundo bloque de la tesis, el diseño y desarrollo de un sistema propio de microarrays (sistemas miniaturizados de amplificación e hibridación con oligonucleótidos fijados en una matriz orgánica) para la detección rápida de la resistencia de algunos de los fármacos antituberculosos más importantes. Tras caracterizar las mutaciones presentes en los aislamientos resistentes de nuestra área y basándose también en las mutaciones más frecuentemente descritas en la literatura, se diseñaron dos microarrays de baja densidad y bajo coste, 1) para la detección de mutaciones relacionadas con la resistencia a la estreptomicina y las fluoroquinolonas (obteniéndose una sensibilidad del 92,5% y el 87,5%, respectivamente; y 2) al etambutol (con una sensibilidad y especificidad del 100%). Este sistema de microarrays se plantea como una buena alternativa a los sistemas comercialmente disponibles, al tener un coste económico menor y ofrecer la flexibilidad de añadir más o diferentes dianas de resistencia, en función del perfil de mutaciones de cada área geográfica.