Desarrollo de nuevos conjugados de activadores del plasminógeno con estreptavidina para la unión "in vivo" a eritrocitos: formación directa en circulación de agentes tromboprofilácticos
- Autores: Óscar Armando Marcos Contreras
- Directores de la Tesis: Juan Carlos Murciano Fernández (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Alcalá ( España ) en 2011
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Eduardo Arilla Ferreiro (presid.), María Cristina Tejedor Gilmartín (secret.), Vicente Gómez del Olmo (voc.), Antonio García García (voc.), Marina I. Garín Ferreira (voc.)
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- Resumen
- español
Las enfermedades cardiovasculares son una de las principales causas de muerte y representan un problema importante a nivel hospitalario, no solo por el coste de los tratamientos y procesos diagnósticos sino también por su elevada mortalidad o las importantes secuelas que pueden dejar en el enfermo. Los tratamientos existentes están muy limitados y en un importante número de casos no existe una alternativa que cumpla todos los requisitos de una terapia controlable y eficiente. Este sería el caso de las alteraciones cardiovasculares asociadas a los procesos quirúrgicos. Actualmente las aproximaciones terapéuticas se centran en el uso de anticoagulantes o el uso de los agentes fibrinolíticos. Tanto una como otra terapia llevan asociados unos efectos secundarios de gran importancia, donde el principal problema radica en la falta de control del desarrollo hemorrágico, sobre todo en aquellos pacientes quirúrgicos. El presente trabajo se basa en descubrimientos farmacológicos previos donde se consiguió el desarrollo de una especie terapéutica distinta en base a la conjugación de un agente fibrinolítico a la superficie del eritrocito, la cual i) aumentaba considerablemente la vida media de los agentes fibrinolíticos, ii) limitaba los efectos secundarios extravasculares, iii) degradaba los coágulos patológicos o circulantes y iv) preservaba la estabilidad de los coágulos hemostáticos. Sin embargo, esta aproximación presentaba un proceso altamente complicado para su aplicación directa al paciente. En esta memoria se presenta el diseño de una nueva especie más aplicable a la clínica donde la formación del conjugado fármaco-eritrocito pueda realizarse directamente sobre la sangre del paciente. Con el fin de dotar al sistema de desarrollo de la mayor universalidad, tanto sobre escenarios experimentales como clínicos, el sistema se centra en la conjugación de la droga fibrinolítica a la molécula de estreptavidina, la cual se une a la superficie del eritrocito portador previamente modificado con biotina. Hay que tener en cuenta que la modificación eritrocitaria mediante biotina (vitamina H) es un proceso utilizado en la clínica, inocuo para el paciente y para la célula portadora. Los primeros pasos se centran en la selección del agente fibrinolítico más adecuado. Con este fin, se utilizan procedimientos metodológicos exhaustivos tanto in vitro como in vivo. Así se realizan ensayos sobre coágulos enriquecidos, o no, con los componentes plásmaticos más importantes (ejemplo los inhibidores de los agentes fibrinolíticos) y procedimientos experimentales representativos de la alteración fisiopatológica habitual (coágulos con mayor grado de fibrina tras situaciones de stress, obesidad, fumadores, aterosclerosis, etc). También se usa un modelo animal de embolia de pulmón en ratón que refleja el desarrollo de la propia enfermedad humana, pero que es altamente controlado y sensible a los tratamientos tanto clásicos, como en desarrollo. Todos estos estudios no solo ayudan a la selección del agente más adecuado para el diseño de esta aproximación terapéutica, sino que arrojan más luz sobre la aplicación de determinados agentes fibrinolíticos en la clínica actual. La elaboración de las primeras aproximaciones de conjugación a los eritrocitos, mediante la unión química directa entre la estreptavidina y el agente fibrinolítico no fueron suficientemente exitosas, por lo que se propuso la generación de proteínas de fusión que por un lado expresaban el núcleo activo de la estreptavidina y por otro el núcleo proteásico del agente fibrinolítico. De esta manera, se utilizó el diseño genético más actual, asi como el uso de plataformas celulares más adecuadas para la futura humanización, producción y purificación de las proteínas generadas. Los agentes de fusión creados utilizaron como nucleo proteásico, el de una especie zimogénica y activable únicamente en el entorno protrombótico y patológico, restringiendo aun más los posibles efectos secundarios de la nueva droga. Pero incluso, el desarrollo de esta nueva especie terapéutica ofrece la posibilidad de ser controlada por un antídoto, con el fin de erradicar el efecto farmacológico cuando este ya no sea necesario en el paciente. Los estudios de circulación y actividad fibrinolítica en el animal arrojaron circulaciones estables y altamente prolongadas en el animal, así como una capacidad fibrinolítica mantenida en el tiempo más allá de las 20-24 horas. En definitiva, el presente estudio arroja resultados interesantes en la comprensión y características de determinadas drogas de uso clínico habitual y presenta la potencial aplicación clínica de un nuevo agente terapéutico, que viene a llenar el vacío farmacológico de un determinado tipo de pacientes de alto riesgo cardiovascular, como es el paciente postquirúrgico.
- English
Cardiovascular diseases represent the first cause of death in developed countries and have become a serious clinical problem in terms of treatment and hospital costs. Available pharmacological approaches are rather restricted and have shown severe limitations due to harmful side effects. Plasminogen activators (PA) evolve as the first choice agent to treat acute and symptomatic vasoocclusive diseases; however, the weakness of their clinical development lies both in the lack of systematic comparative studies among the existing drugs and their experimental models, and in the inadequate application to surgical patients. This work tries to fill this gap and focuses on the improving of a new and promising pharmacological approach, in which a plasminogen activator is associated to the red blood cell (RBC) surface. From this privileged location, the fibrinolytic agent I) extends dramatically its half life, reducing the required doses and its side effects, II) remains in circulation, where its activity is required, and III) dissolves specifically the nascent, pathological clots, while preventing the dissolution of the haemostatic, good ones. In order to succeed, work started by deeply analyzing the available and most extended clinical plasminogen activators, both in vitro and in vivo, and found interesting concepts about their sensitivity to plasma inhibitors and their capacities to act on the clots at different levels. The obtained data also suggested that reteplase could be an interesting approach to treat easily accessible thrombi/emboli, based on its capacity to diffuse within the clot matrix, improving clot dissolution both from the outside and from the inside. The methodological procedure gathered these results from the dissolution of clots of a) extremely controlled composition, b) selectively adjusted drug concentrations, and c) elaborated platforms to picture all possible pathological approaches. These results were reproduced, as well, in an extensively validated murine model of pulmonary embolism, which mimics the in vivo pathological environment. However, none of the studied clinical drugs offered enough possibilities for direct conjugation to RBC. Thus, subsequent efforts focused on an innovative fusion protein approach, where the cores of two major proteins, in this case a universal bridging streptavidin core (SA) along with the latent thrombin-activatable urokinase (UK-T), resulted in a promising RBC delivery. The generated conjugate is capable of being universally tested across different animal and human platforms and, more importantly, it is selectively activated within the nascent clot environment, not showing activity or sensitivity to PA inhibitors in other blood locations. This approach went even further with the generation of a fusion protein, which retains the major characteristics of the SA-UK-T complex, but markedly reduces its affinity for biotin by impeding tetramerization of the SA core (mFP). This new fusion protein included the ability to control its permanence in circulation by using pure SA, which will displace the mFP from the RBC carrier. These data were generated using a) precisely adjusted cell culture system for the production of the fusion protein, as well as phage display and genetically engineered plasmids, b) biochemical characterization and activity analysis of the protein purification and its RBC conjugates, c) studies of their maintenance in the bloodstream by using doubly isotopically labeled conjugates, and d) demonstration of their fibrinolytic capacity on nascent autologous blood clots. Altogether, this work demonstrated the ability to generate therapeutical approaches both at the level of conventional drugs and at the level of new drug delivery agents. At the same time, it offers some hope for the improvement of the clinical management of cardiovascular patients, especially for those who require a surgical procedure and will be exposed to a higher risk of coagulation. Such hope resides in the development of a conjugated RBC with a promising and displaceable latent plasminogen activator, which only dissolves pathological clots and could be eliminated when its activity is no longer required.
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