Resumen de Regulation of self-renewal in colorectal cancer cell models

Oscar Meca Cortés

• Abstract The transcription factor SOX2 is a key determinant of stem cell properties, also involved in the initiation, maintenance and progression of several human cancers. By studying the in vitro phenotypic consequences of SOX2 overexpression and knock down in a panel of cell lines, we have found that high levels of SOX2 leads to DNA damage and accumulation of reactive oxygen species, accompanied with cell cycle arrest and apoptosis. We have also found that knock down of SOX2 in the metastatic colorectal cancer cell line SW620 also led to cell cycle arrest, partially dependent on the cyclin-dependent kinase inhibitors p21 and p27, and abrogation of anchorage-independent growth and tumor growth in vivo. Knock down of SOX2 caused the upregulation of p27 and reporter assays combining knock down and overexpression of SOX2 suggest that SOX2 may act as a negative transcriptional regulator of p27. Knock down of p27 partially reverted the cell-cycle arrest induced by SOX2 knock down but was insufficient to restore anchorage-independent growth. In addition it also led to the downregulation of LGR5 transcript levels but it is unknown if this regulation is mediated directly by SOX2 or by other mechanisms. Knock down of LGR5 in SW620 cells abrogated their anchorage-independent growth in vitro and tumor growth in vivo, in spite of a strong induction of ß-catenin transcriptional activity. Activation of ß-catenin activity upon LGR5 knock down was paralleled by a decreased membrane association and enhanced nuclear translocation but not by ß-catenin protein accumulation or downregulation of the Wnt-ß-catenin negative regulators ZNRF3 or RNF43. These results indicate that LGR5 is a negative regulator of canonical Wnt signaling in the absence of their cognate ligands (R-spondins) and that high ß-catenin/TCF/LEF transcriptional activity does not involve necessarily increase of self-renewal potential in colorectal cancer cell models. Resumen Tesis Doctoral Oscar Meca El factor de transcripción SOX2 es una proteína clave implicada en las propiedades adscritas a células madre y también está implicado en la iniciación, mantenimiento y progresión tumoral en distintos tipos de cáncer. Mediante estudio in vitro de las consecuencias fenotípicas de la sobreexpresión y represión de SOX2 en un grupo de líneas celulares, hemos encontrado que altos niveles de SOX2 induce daño al DNA y acumulación de especies reactivas de oxígeno, arresto en ciclo celular y apoptosis. También hemos observado que la represión de SOX2 en la línea metastásica de cáncer colorrectal SW620, indujo arresto en ciclo celular parcialmente dependiente en los inhibidores de ciclina dependiente de kinasa p21 y p27, junto a una drástica reducción en la formación de esferoides en condiciones independientes de anclaje a sustrato y de tumorigenicidad in vivo. La represión de SOX2 indujo el aumento de expresión de p27 y los análisis con plásmidos reporteros combinando represión y sobreexpresión de SOX2 sugieren que este factor de transcripción podría actuar como un regulador transcripcional negativo de p27. A su vez, la represión de p27 revirtió parcialmente el arresto en ciclo celular inducido por la represión de SOX2 pero no recuperó el crecimiento de esferoides en condiciones independientes de anclaje a sustrato. Además, también indujo la bajada de expresión de los niveles de LGR5 aunque no se ha podido determinar en este estudio si esta regulación está mediada directamente por SOX2 o por otros mecanismos. La represión de LGR5 en la línea SW620 también produjo una reducción significativa en la capacidad de formar esferoides en condiciones independientes de anclaje a sustrato in vitro y de crecer tumores in vivo, a pesar de incrementar de manera relevante la actividad transcripcional de la ß-catenina. El incremento de la actividad de la ß-catenina al reprimir LGR5, fue concomitante a la reducción de la fracción de esta proteína unida a membrana y al aumento de su translocación nuclear pero no a la acumulación de la proteína o a la bajada de expresión de los reguladores negativos de la ruta canónica de Wnt, ZNRF3 o RNF43. Estos resultados indicant que LGR5 es un regulador negative de la ruta canónica de la señalización Wnt en la ausencia de los ligandos conocidos (R-spondinas) y que la elevada actividad transcripcional del complejo formado por ß-catenina/TCF/LEF no implica necesariamente el incremento del potencial de auto-renovación en los modelos celulares de cáncer colorrectal estudiados.