Estudi de l'expressió i secreció de proteïnes recombinants (agarasa i lacasa) en una soca SipY- de Streptomyces lividans
- Autores: Marcel·La Vidal Gabarró
- Directores de la Tesis: Josep López Santín (dir. tes.), Gloria Caminal Saperas (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat Autònoma de Barcelona ( España ) en 2014
- Idioma: catalán
- Tribunal Calificador de la Tesis: Francisco Ignacio Javier Pastor Blasco (presid.), Pau Ferrer Alegre (secret.), Pere Clapés Saborit (voc.)
- Materias:
- Enlaces
- Resumen
La producció de proteïnes homòlogues i heteròlogues a escala industrial requereix sistemes d’expressió variats i eficients. Els bacteris grampositius, com Streptomyces, poden ser una alternativa per a la producció de proteïnes recombinants ja que aquestes són produïdes i secretades al medi. La sequ?enciació del genoma d’algunes espècies de Streptomyces i el seu anàlisi post-genòmic ha permès determinar i caracteritzar la seva maquinària de secreció. Així, se sap que els precursors de les proteïnes que s’han de secretar són exportats majoritàriament per una via principal de secreció (via Sec) o bé per una via secundària (via Tat). Aquests precursors contenen un pèptid senyal de tipus I que permet la seva correcta translocació a través de la membrana plasmàtica, la sequ?ència del qual determina per quina de les dues vies es dirigeix. Un cop translocades, les peptidases senyal de tipus I (SPases) processen la majoria d’aquestes proteïnes secretades i les alliberen al medi extracel·lular en la seva forma madura. Estudis previs en la maquinària de secreció han determinat que Streptomyces lividans té quatre peptidases senyal Sip (SipW, SipX, SipY i SipZ) de les quals, SipY és la que desenvolupa el paper majoritari. La soca deficient en aquesta proteïna SipY té la capacitat de secreció notablement afectada però, paradoxalment, és un bon hoste per a la sobreproducció de proteïnes secretades, ja que presenta una activitat proteàsica considerablement disminuïda. En aquest treball s’ha estudiat la producció d’agarasa i de lacasa en la soca SipY- (S. lividans ?sipY) a escala de bioreactor per avaluar si aquesta soca pot ser considerada com a possible hoste per a la producció de proteïnes recombinants per la indústria. Aquestes dues proteïnes se secreten majoritàriament per la via Tat. En el cas de l’enzim agarasa, el gen expressat prové de S. coelicolor A3(2) i s’ha produït l’enzim en discontinu amb la soca salvatge (S. lividans TK21pAGAs5) i la soca mutada (S. lividans ?sipYpAGAs5). La soca S. lividans ?sipYpAGAs5 ha presentat una millor producció i s’ha seleccionat el medi més adequat per tal de produir aquesta proteïna estudiant el seu comportament operant en continu. També s’han estudiat diferents estratègies en discontinu alimentat, entre les quals la major producció s’ha obtingut amb una addició de mannitol i evitant que aquesta font de carboni s’esgoti en el medi. En el cas de la lacasa, s’han construït tres soques en les quals el gen de la pròpia lacasa de S. lividans és regulat per tres promotors diferents: el promotor propi de la lacasa, el promotor del gen de resistència a eritromicina i el promotor del gen agarasa de S. coelicolor. La soca en el qual el gen és regulat pel promotor del gen agarasa (S. lividans ?sipYpFD-DagA-laccase) ha estat seleccionada i s’ha estudiat la producció de l’enzim utilitzant mannitol o glucosa com a font de carboni en discontinu i discontinu alimentat. En l’operació en discontinu alimentat van ser necessàries dues addicions de glucosa per assolir els mateixos nivells de producció que amb una addició de mannitol.
