Nous dissenys biomoleculars en genosensors i immunosensors per a la seguretat alimentària

• Autores: Ana Isabel Lermo Soria
• Directores de la Tesis: Salvador Alegret Sanromà (dir. tes.), María Isabel Pividori (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat Autònoma de Barcelona ( España ) en 2009
• Idioma: catalán
• Tribunal Calificador de la Tesis: Jordi Bartrolí i Molins (presid.), José Manuel Pingarrón Carrazón (secret.), Hideko Yamanaka (voc.)
• Materias:
  • Química
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en:  TDX  DDD 
• Resumen

  • Al camp alimentari hi ha una creixent demanda de metodologies analítiques que siguin ràpides, selectives i econòmiques, que permetin la detecció de diferents contaminants alimentaris per a garantir la seguretat del producte al llarg de la cadena alimentària de producció. En aquest context, els biosensors electroquímics s'alcen com a candidats ideals com alternativa a la instrumentació analítica convencional per a l'anàlisi fora de l'àmbit del laboratori. En aquesta tesi es van desenvolupar nous dissenys biomoleculars basats en biosensors electroquímics per a la seguretat alimentària abordant tres aspectes crítics dels dispositius biosensors, que convergeixen cap a la simplificació metodològica: la immobilització orientada del biomaterial, la marcació i la transducció del senyal electroquímic. Donada l'experiència del nostre grup d'investigació en la fabricació de compòsits de grafit-epoxi (GEC) i els avantatges electroquímics demostrats d'aquest material, es van construir nous transductors electroquímics basats en compòsits rígids per a la immobilització orientada de biomolècules per aconseguir la simplificació metodològica en la detecció de DNA i immunoespècies. Els nous transductors construïts es van basar en: i) biocompòsits de grafit-epoxi modificats en volum amb la proteïna avidina (Av-GEB), i ii) compòsits amb un element magnètic integrat (m-GEC). Els biocompòsits d'avidina constitueixen una plataforma universal per a la immobilització directa orientada de material biològic biotinilat, mitjançant la forta unió avidina-biotina. El propi transductor actua com a reservori de material biològic i es pot renovar amb un simple procediment de polit, obtenint una nova superfície per cada assaig. Els magneto elèctrodes permeten la integració de partícules magnètiques als procediments biosensors per tal de realitzar les reaccions biològiques de biorreconeixement en solució, reduint la complexitat de la matriu de les mostres i preconcentrant l'anàlit, obtenint així, una detecció més sensible. Es va dissenyar una nova estratègia de detecció de DNA provinent de mostres reals dels bacteris patògens Salmonella i Escherichia coli, mitjançant la incorporació d'encebadors marcats a la mescla de reacció de la PCR. A part d'amplificar la quantitat de DNA, es va aconseguir marcar doblement el producte amplificat amb biotina i digoxigenina, per aconseguir la immobilització posterior a partícules magnètiques recobertes d'estreptavidina o Av-GEB i la unió d'un conjugat enzimàtic (antiDIG-HRP) per a detectar el producte amplificat. Així es van obtenir uns protocols simples, ràpids i molt sensibles. Aquests protocols van proporcionar límits de detecció més baixos en comparació amb la tècnica clàssica de gel d'electroforesi i la PCR quantitativa amb sistema TaqMan. També es van obtenir resultats molt prometedors incorporant a la PCR un encebador magnètic, encebador unit a partícules magnètiques. Així, es va aconseguir l'amplificació directa a la superfície de les partícules magnètiques, simplificant la metodologia. Aquesta estratègia presenta potencial aplicabilitat per a la detecció directa electroquímica de productes amplificats al termociclador de la PCR. A l'últim bloc de la tesi es va desenvolupar una estratègia immunosensora simplificada amb detecció electroquímica, en la que l'haptè es va immobilitzar a partícules magnètiques recobertes de grups químics tosil, formant un enllaç covalent amb la molècula de naturalesa haptènica. Amb aquesta estratègia es va aconseguir quantificar l'àcid fòlic en mostres cegues de llet enriquida, obtenint valors de recuperació propers al 100%; i quantificar l'àcid fòlic en mostres reals de llet enriquida, obtenint valors molt propers als indicats a la composició dels productes.