Resumen de Estudi dels mecanismes moleculars subjacents en mutacions CFTR que afecten l’eficiència de l’splicing. Desenvolupament de tècniques complementàries per a la caracterització a nivell de DNA, RNA i proteïna en cèl·lules epitelials
Laia Masvidal Sanz
La Fibrosis quística (FQ) és la malaltia genètica recessiva letal més freqüent a la població caucàsica. Més de 1600 mutacions al gen CFTR han estat descrites com a responsables de FQ i/o han estat associades a altres malalties com l¿absència bilateral de conductes deferents, la pancreatitis crònica i les bronquiectàsies. El procés d’splicing està estrictament regulat per diferents seqüències genòmiques i factors de transcripció. Aquest fi engranatge és susceptible de veure’s afectat de forma absoluta o parcial per la presència de mutacions, donant lloc a un número variable de transcrits i, en conseqüència, a un ampli espectre fenotípic. Per determinar la rellevància clínica dels nivells d'expressió de CFTR, l’objectiu principal d’aquest treball ha estat l’estudi dels mecanismes moleculars subjacents en mutacions CFTR que afecten l’splicing, mitjançant el desenvolupament de tècniques complementàries per la seva caracterització a nivell de DNA, RNA i proteïna. Per dur a terme aquest objectiu s’ha emprat l’epiteli nasal, una mostra accessible, que ens ha permès, l’anàlisi d’expressió del gen i la localització de la proteïna CFTR. La seva caracterització genòmica ha estat fonamental per la identificació de mutacions i SNPs, i ha permès la formació acurada de grups d’estudi (individus controls, portadors i pacients). L’RT-qPCR ha estat una tècnica essencial i la normalització de dades n'és un pas imprescindible per determinar l'expressió. En aquest treball s'ha aplicat un procés acurat de selecció de gens de referència (geNorm, NormFinder, Kruskal-Wallis) i s’han validat els gens GUSB i PMCA4 com la millor combinació per l’estudi de l’expressió de CFTR. L’anàlisi in silico i qualitatiu de més de 30 mutacions missense, nonsense i d’splicing al gen CFTR ha permès la identificació de transcrits aberrants en les mutacions c.580-1G>T, c.2657+5G>A i c.3718-1G>A. La quantificació de transcrits per la mutació c.2657+5G>A ha portat a la identificació d’un nou al·lel complex amb el cSNP c.2562T>G (p.=). A nivell proteic, la manca de proteïna observada en les tres mutacions correlaciona amb els nivells de transcrits quantificats en cada una de elles, i ambdós ho fan amb el fenotip dels individus portadors de mutacions d’splicing. En conclusió, l’anàlisi quantitativa de transcrits ha mostrat una correlació amb el fenotip d’individus portadors de mutacions d’splicing, i en conseqüència pot ser útil com a paràmetre complementari per a l’avaluació de teràpies moleculars dirigides a la correcció d’splicings aberrants.
