Structural Insights into Substrate Binding and Regulation of E3 Ubiquitin Ligases in the Nedd4 Family using NMR Spectroscopy

• Autores: Albert Escobedo Pascual
• Directores de la Tesis: María Jesus Macías Hernández (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2014
• Idioma: inglés
• Tribunal Calificador de la Tesis: Ernest Giralt Lledó (presid.), Gemma Villorbina Noguera (secret.), Giovanna Musco (voc.)
• Materias:
  • Química
    • Química analítica
      • Espectroscopia de resonancia magnética
    • Bioquímica
      • Péptidos
    • Química macromolecular
      • Polipéptidos y proteínas
  • Ciencias de la vida
    • Biofísica
      • Bioenergética
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en:  TDX  Dipòsit Digital de la UB 
• Resumen

  • Structural Insights into Substrate Binding and Regulation of E3 Ubiquitin Ligases in the Nedd4 Family using NMR Spectroscopy Nedd4L es una E3 ubiquitín ligasa del tipo HECT (une covalentemente las moléculas de ubiquitina antes de transferirlas al sustrato). Es responsable de la regulación de la vida media del canal de sodio ß-ENaC así como de Smad2/3, proteínas mediadoras de la ruta de señalización activada por citoquinas del tipo TGF-ß. Defectos en su función han sido relacionados con la hipertensión hereditaria (Síndrome de Liddle), y podrían ser relevantes en ciertos tipos de cáncer y metástasis. CDK8/9 y GSK-3ß son dos quinasas que regulan el estado de fosforilación de las Smads, habilitándolas para llevar a cabo su función en cooperación con factores de transcripción a la vez que las marcan para ser reconocidas por ubiquitín ligasas. Con el objetivo de identificar los residuos y los patrones de fosforilación relevantes en estas interacciones hemos preparado un set de fosfopéptidos que corresponden a las secuencias de Smad1/3. Igual que los otros miembros de la familia Nedd4, Nedd4L presenta una arquitectura multi-dominio C2-WW-HECT. Varias ligasas de la familia existen en una conformación latente establecida mediante contactos inter-dominio que ocluyen el sitio catalítico en el dominio HECT, involucrando ya sea el dominio C2 (Smurf1/2, WWP2, Nedd4, Nedd4L) o la zona próxima a los dominios WW (Itch). Determinados eventos celulares desplazan dichos contactos, induciendo la transición a la conformación activa. En el caso de Nedd4L, el incremento de los niveles intracelulares de Ca2+ activa la ligasa. La hidrólisis del fosfolípido de membrana fosfatidilinositol 4,5-bisfostato (PIP2) libera el inositol 1,4,5-trifosfato (IP3), un segundo mensajero que moviliza las reservas intracelulares de Ca2+. El dominio C2 de Nedd4L es capaz de interaccionar tanto con el Ca2+ como con el IP3. Mediante una aproximación estructural y biofísica centrada en la RMN hemos descrito las interacciones específicas entre los dominios HECT y C2 que inhiben la función catalítica. El Ca2+ se une con alta afinidad al dominio C2 usando la misma superficie de unión y compromete dichos contactos, y además media la interacción con el IP3. Estos resultados proporcionan el fundamento estructural de la activación y la relocalización a la membrana plasmática de Nedd4L mediadas por Ca2+. El dominio HECT presenta un sitio PY altamente conservado (HECT-PY). Los motivos PY son las secuencias de reconocimiento de los dominios WW. Planteamos la posibilidad que el reconocimiento del motivo HECT-PY por uno de los dominios WW de Nedd4L tenga un papel en la auto-ubiquitinación de la ligasa. Nuestros datos confirman que solo cuando el plegamiento del dominio HECT está parcialmente dañado, el sitio PY es accesible para el reconocimiento por parte de los dominios WW. Presentamos la estructura por RMN del complejo entre el dominio WW3 y el motivo HECT-PY. El sitio está protegido en moléculas de Nedd4L funcionales, capaces de reconocerlo en moléculas dañadas y ubiquitinarlas para su degradación.