Estudis bioquímics i funcionals de les proteïnes implicades en la Leucoencefalopatia Megalencefàlica amb Quists subcorticals

• Autores: Xavier Capdevila Nortes
• Directores de la Tesis: Raúl Estevez Povedano (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2013
• Idioma: catalán
• Tribunal Calificador de la Tesis: Ana María Planas Obradors (presid.), José Julio Chillarón Chaves (secret.), José Manuel Fernández Fernandez (voc.)
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Biología celular
    • Fisiología humana
      • Neurofisiología
      • Fisiología del sistema nervioso central
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en:  TDX  Dipòsit Digital de la UB 
• Resumen

  • La Leucoencefalopatia Megalencefàlica amb Quists subcorticals (MLC) és un tipus rar de leucodistròfia vacuolitzant de progressió lenta, que presenta com a principals característiques clíniques macrocefàlia acusada durant els primers anys de vida, deteriorament de les funcions motores, epilèpsia i retard mental de grau mig. L’any 2001 es va identificar el primer gen responsable de la malaltia en humans denominat MLC1, tot i que existien pacients de MLC que no presentaven mutacions en MLC1 ni lligació amb el seu locus. Això suggeria que hi havia com a mínim un altre gen involucrat en la malaltia. MLC1 codifica per una proteïna de membrana que porta el mateix nom que s’expressa en cèl•lules glials. La funció de MLC1 és desconeguda però estudis bioquímics van mostrar que mutacions en aquesta proteïna provoquen una reducció dels nivells de proteïna a la membrana i una forta retenció al reticle endoplasmàtic. L’objectiu general d’aquesta Tesi és avançar en la comprensió del possible mecanisme d’acció i la funció de la proteïna MLC1 i així aprofundir en el coneixement de la fisiopatologia de la malaltia. Per realitzar aquest objectiu es va seguir l’aproximació experimental d’identificar i analitzar l’interactoma de MLC1. Per poder validar interaccions entre proteïnes de membrana es va utilitzar el mètode PCA de Split-TEV. Es va observar que el mètode no presentava suficient especificitat i per això, es van realitzar una sèrie de modificacions en la tècnica per obtenir una nova variant de la metodologia amb alta sensibilitat i especificitat. Paral•lelament, es van realitzar estudis de genòmica i proteòmica que van permetre obtenir un llistat de proteïnes candidates a interaccionar amb MLC1. Es van seleccionar les proteïnes més interessants i es va validar la interacció amb MLC1 per coimmunolocalització en cultius primaris d’astròcits de rata i pel mètode de Split-TEV. Mitjançant col•laboracions del grup es va realitzar un estudi genètic dels candidats favorables a interaccionar amb MLC1 i així es va identificar a GlialCAM com a segon gen implicat en MLC. GlialCAM és una proteïna amb una estructura similar a les proteïnes d’adhesió que s’expressa en cèl•lules glials. Estudis del grup van descriure a GlialCAM com a subunitat ? de MLC1 i subunitat auxiliar del canal de clorur ClC-2, ja que és capaç d’interaccionar i dirigir aquestes proteïnes a les zones de contacte entre cèl•lules i provocar canvis funcional en el canal. El descobriment de GlialCAM va fer focalitzar els objectius de la Tesi en l’estudi d’aquesta proteïna. Es van realitzar estudis d’estructura-funció de GlialCAM mitjançant la utilització de proteïnes quimèriques i la generació de delecions. Aquests estudis van identificar el domini extracel•lular de GlialCAM com a domini responsable de la interacció en cis i en trans de la proteïna. El domini citoplasmàtic es va relacionar amb la localització de la proteïna a les unions cel•lulars i finalment, es van identificar els primers aminoàcids del domini transmembrana de GlialCAM com els responsables dels canvis funcionals de ClC-2. També es van generar i caracteritzar els models knock-down tant de MLC1 com de GlialCAM en cultius primaris d’astròcits de rata. L’estudi d’aquests models i de complementacions dels models amb l’expressió de proteïnes humanes o diferents mutacions de MLC1 i GlialCAM, van permetre descriure GlialCAM com a xaperona necessària per la sortida del reticle endoplasmàtic i la localització de MLC1 a les unions astrocitàries. Estudis funcionals van permetre relacionar MLC1 amb l’activitat VRAC i el control del volum cel•lular i es va identificar com a proteïna responsable de l’aparició de vacuoles astrocitàries en els pacients de MLC. Finalment, es va observar que les mutacions en MLC1 eren capaces d’activar VRAC per se i causaven el defecte en trobar-se retingudes. La coexpressió de GlialCAM amb aquestes mutacions de MLC1 provocava una recuperació de la localització de MLC1 i una disminució del fenotip vacuolitzant astrocitari. Aquest resultat podria ser el principi d’una possible teràpia pels pacients amb MLC basada en l’augment de l’expressió en superfície de les variants mutants de MLC1.