Resumen de Embriogénesis somática en pino piñonero ("Pinus pinea" L.)
- español
El pino piñonero (Pinus pinea L.) es una de las especies arbóreas más características de la flora mediterránea, con gran importancia ecológica, social y económica. Debido a su rusticidad y porte aparasolado puede considerarse como especie destinada a usos paisajísticos y recreativos, pero su aprovechamiento principal es el fruto (piñones comestibles), siendo España uno de los países con mayor producción. La mejora genética de esta especie va orientada fundamentalmente a una utilización agronómica y requiere la identificación de individuos buenos productores de piña y piñón. El pino piñonero se muestra recalcitrante en su capacidad morfogénica, por lo que es necesario desarrollar técnicas de propagación vegetativa eficaces que permitan la mejora de esta especie. La embriogénesis somática es un proceso in vitro que incluye el desarrollo de masas embriogénicas en embriones bipolares capaces de madurar, germinar y aclimatarse a condiciones ex vitro. Hoy se considera como la vía más adecuada para la micropropagación clonal de especies forestales, alcanzándose recientemente grandes progresos en las coníferas. Este trabajo se ha centrado en el estudio de determinados aspectos de la embriogénesis somática, utilizada como vía para la regeneración clonal de árboles selectos de pino piñonero, siendo la primera vez que se ha abordado esta técnica de micropropagación en esta especie. La memoria de tesis se ha dividido en varios capítulos, que se corresponden con las sucesivas fases del proceso: inducción de la respuesta embriogénica, proliferación y mantenimiento del material embriogénico inducido, maduración de los embriones somáticos, germinación y conversión de los embriones en plantas. Además se ha evaluado el efecto de la crioconservación sobre la recuperación del crecimiento de distintas líneas embriogénicas. Se ha estudiado la respuesta embriogénica de diferentes tipos de explantos, tanto embrionarios (embriones cigóticos maduros e inmaduros) como no embrionarios (estróbilos femeninos, estróbilos masculinos, acículas en expansión, yemas y hojas de inserción aislada). Para ello se han ensayado distintas condiciones de inducción, donde se ha evaluado la influencia de factores como el genotipo, la composición del medio nutritivo, y tipos y niveles de reguladores del crecimiento. Únicamente se ha conseguido la respuesta embriogénica a partir de explantos embrionarios, aunque con los no embrionarios se han obtenido respuestas prometedoras. Las mayores frecuencias de inducción se han obtenido con los embriones cigóticos inmaduros. El protocolo de inducción se ha basado en el cultivo de megagametofitos completos, la aplicación de los reguladores del crecimiento 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético) y BAP (6-bencilaminopurina), y un aporte de nitrógeno orgánico. El tejido embriogénico aparece en forma de extrusión en el extremo del micropilo del megagametofito. La proliferación del material embriogénico se ha llevado a cabo en el medio de inducción modificado, manteniéndose ésta capacidad proliferativa con el tiempo, siendo su potencial multiplicativo muy alto. Para el mantenimiento de las líneas embriogénicas se han realizado subcultivos bisemanales a medio de cultivo fresco. La diferenciación de los embriones somáticos ha requerido un precultivo de las masas embriogénicas en medio con los nutrientes reducidos y bajas concentraciones de reguladores; posteriormente, las masas se han disgregado en medio con carbón activo, cultivándose en presencia de ABA (ácido abscísico) y alto contenido osmótico. La desecación parcial de las masas embriogénicas ha favorecido la maduración. Cuando los embriones alcanzan el estado cotiledonar se ha procedido a su germinación, y a la transferencia a condiciones ex vitro de las plantas somáticas para su aclimatación. Las frecuencias de iniciación de tejido embriogénico en el pino piñonero han sido relativamente bajas, pero similares a las obtenidas inicialmente en otras especies del género Pinus. Se sugiere la existencia de una ventana en el desarrollo del embrión cigótico más sensible a la inducción, pues las mayores respuestas se han obtenido cuando el embrión se encontraba entre el estado de poliembrionía de partición y el estado cotiledonar inicial. El medio de cultivo y los reguladores del crecimiento también han influido en las frecuencias de iniciación, obteniéndose los mejores resultados con el medio Litvay modificado, suplementado con L-glutamina e hidrolizado de caseína y la combinación de 9 ?M de 2,4-D y 4,5?M de BAP. Se ha observado una fuerte influencia del genotipo en las fases de inducción, proliferación y maduración de los embriones somáticos. La maduración de los embriones somáticos se ha visto afectada por la elevada de proliferación de los cultivos, no obstante se han obtenido tasas de maduración similares a las de otras especies de pinos. La germinación de los embriones somáticos se ha mejorado realizando un tratamiento pregerminativo de los cultivos en frío. La germinación de los embriones se ha visto influída por su posición en los medios de cultivo, obteniéndose mayores frecuencias cuando se disponen en las placas en posición horizontal y éstas se inclinan 40º. El desarrollo de las plántulas se ha estimulado modificando el medio de cultivo y la intensidad luminosa. Se ha logrado la regeneración de plantas a partir de los embriones germinados, a través de la optimización de las fases de maduración y germinación. Se ha desarrollado un protocolo de crioconservación de líneas embriogénicas de pino piñonero, lo que evitaría la pérdida de vigor y capacidad morfogénica de las masas embriogénicas por el cultivo prolongado. Se ha evaluado la influencia de los agentes crioprotectores (sorbitol y DMSO) en la viabilidad del material embriogénico, observándose un cierto grado de toxicidad que revierte con los subcultivos además de la influencia del genotipo en la respuesta. La recuperación del crecimiento de las líneas embriogénicas crioconservadas pasa por una fase de latencia, igualándose al crecimiento de las líneas no crioconservadas con los subcultivos. La mezcla de 0,4 M de sorbitol y 15 % de DMSO ha proporcionado la mayor tasa de recuperación. Ha sido posible la maduración y germinación de los embriones somáticos procedentes del material crioconservado, obteniéndose embriones capaces de convertirse en plantas.
- English
Stone pine (Pinus pinea L.) is one of the most characteristic tree species of the Mediterranean basin because of its ecological, social and economical importance. Due to its rusticity and its singular umbrella shape, it can be used for ornamental planting and recreational purposes, but edible seeds (pine nuts) are its main product, being Spain one of the countries with major production. Stone pine breeding program is mainly focused on giving an agronomic value to this species and needs the identification of high productive genotypes. Stone pine is a recalcitrant species for morphogenic ability. Therefore, developing vegetative propagation technologies for the improvement of this species is of paramount importance. Somatic embryogenesis is an in vitro process that includes the development of embryogenic masses into bipolar embryos that are able to differentiate, germinate and acclimatize to ex vitro conditions. At present, it is considered as the most suitable way for clonal micropropagation of forest species, having conifers achieved great progresses recently. This study focuses on some aspects of somatic embryogenesis for clonal regeneration of selected Stone pine trees. This thesis has been divided into several chapters, related to the consecutive phases of the process: induction of the embryogenic response, proliferation and maintenance of embryogenic cultures, maturation of somatic embryos, somatic embryo germination and conversion. The effect of cryopreservation on growth recovery of different embryogenic lines has also been studied. The embryogenic response has been studied in explants of different origins, embryonic (mature and inmature zygotic embryos) and non embryonic (male and female strobili, expanding needles, shoot apices and brachiblasts leaves). Different induction conditions have been tested evaluating the influence of factors like genotype, basal medium components, and types and levels of plant growth regulators. Embyogenic response has only been achieved on embryonic explants, although promising responses have been obtained in non embryonic. The highest induction frequencies have been achieved on inmature zygotic embryos. For induction, whole megagametophytes have been cultured and the application of 2.4-D (2.4-dichlorophenoxiacetic acid), BAP (6- benzylaminopurine) and organic nitrogen has been necessary. The embryogenic tissue is produced from the micropylar end of megagametophytes and its proliferation has been carried out in the induction media with slight modifications, without declining the multiplication ability with time. The embryogenic lines have been subcultured biweekly onto fresh maintenance medium. A preculture of embryogenic masses in a medium with reduced components and low concentrations of growth regulators has been required for somatic embryos differentiation; then, masses have been suspendend in liquid medium with activated charcoal and the suspension has been cultivated in the maturation media supplemented with ABA (abscisic acid). Once somatic embryos reach the cotiledonary stage germination is carried out. Although the induction of somatic embryogenesis in Stone pine is achieved at very low frequency, it has been very similar to those obtained in initial studies of other species of pines. It is suggested the existence of a developmental window that could be more prone to induction, as the highest frequencies of SE induction occurred when zygotic embryos were in the cleavage polyembryony to initial cotyledonary stages. The culture medium composition and plant growth regulators have also influenced on induction frequencies, being a modified Litvay’s medium supplemented with L-glutamine, casein hydrolysate, 9 μM 2.4-D and 4.5μM BAP the most suitable one. A strong influence of genotype has been observed on induction, proliferation and maintenance phases. Vigorous proliferation of embryogenic tissue has hampered differentiation and maturation of somatic embryos, even though similar maturation rates to other pine species have been obtained. The culture of somatic embryos at low temperature has improved their germination. Embryo position in the culture medium also has influenced its germination, having higher frecuencies when embryos are placed horizontally on medium and tilting the Petri dishes to a slanted position at an angle of approximately 40º. Regeneration of plants from somatic embryos has been achieved, through the optimization of maturation and germination phases. A cryopreservation protocol for embryogenic lines of Stone pine has been developed, which would avoid the loss of vigour and morphogenic ability of embryogenic lines due to prolonged cultures. The influence of cryoprotective agents on the viability of embryogenic tissue (sorbitol and DMSO) has been evaluated, noticing a slight degree of toxicity that reverts with subcultures, an influence of genotype in the response has also been observed. The regrowth of cryopreserved embryogenic lines goes through a lag phase. The combination of 0.4 M sorbitol and 15 % de DMSO has proportioned the highest recovery rates. Maturation of somatic embryos from cryopreservation and its germination has been possible.
