Resumen de Estudio de la composición de los gránulos corticales y del oolema de ovocitos porcinos y bovinos madurados y fecundados in vitro
María Dolores Saavedra Leos
La polispermia (entrada de más de un espermatozoide al ovocito) es una condición patológica en mamíferos ya que impide el desarrollo embrionario. En la especie porcina, la polispermia es un problema común y aún sin resolver en los sistemas de fecundación in vitro (FIV). Los gránulos corticales (GCs) de los ovocitos de mamíferos estan implicados en el bloqueo de la polispermia, sin embargo, poco se sabe acerca de la composición y función de estas organelas. Esta ampliamente descrito que las moléculas liberadas de los GCs durante la fecundación o activación ovocitaria mediante estimulación química o eléctrica producen importantes modificaciones, particularmente en la zona pelúcida (ZP), el espacio perivitelino y, probablemente, el oolema del ovocito. Estas modificaciones repercuten directamente en el bloqueo de la polispermia. El conocimiento del contenido de los GCs y proteínas del oolema así como su papel durante la fecundación en la especie porcina es escaso. La mayoría de la información que se tiene en la actualidad se ha obtenido del modelo murino. En la presente tesis doctoral, investigamos la presencia de posibles proteínas de los GCs en ovocitos porcinos así como la presencia de metaloproteasas ADAM-10 y ADAM-17 en ovocitos porcinos y bovinos. Para ello, este estudio se dividió en tres apartados: I. Se evaluó el efecto del contenido de los GCs obtenido mediante interacción de gametos de las especies porcina y bovina sobre la FIV y endurecimiento de la ZP de ovocitos porcinos. Puesto que tras la interacción del espermatozoide con el oolema del ovocito maduro se produce la exocitosis de los GCs, se realizó una interacción de gametos utilizando ovocitos libres de ZP. Durante la interacción de los gametos, se produce la reacción cortical y el contenido de los GCs se libera al medio de cultivo, que es utilizado como fuente de exudado de GCs de la especie porcina y bovina. Este exudado se empleó para analizar su contenido proteico y para incubar ovocitos porcinos estudiando por un lado la resistencia de la ZP a la digestión con proteasa y, por otro, su efecto en los resultados de FIV porcina. Los resultados obtenidos en este primer apartado indican que el medio de cultivo que contiene el exudado de los GCs de ovocitos porcinos y bovinos disminuye la penetración (%PEN) y el número de espermatozoides unidos a la ZP (%SPZ-ZP), y produce un aumento en la monospermia (%MONO) en ovocitos porcinos durante la FIV comparado con el control. Cabe destacar que los resultados antes mencionados fueron mucho más evidentes cuando los ovocitos porcinos se incubaron con el exudado de los GCs de la especie bovina comparado con el exudado de los GCs de la especie porcina y el grupo control (% PEN: 43'5, 84'0, 98'3 respectivamente), (%SPZ-ZP: 52'5, 66'4, 95'0 respectivamente), (%MONO: 69'9, 12'8, 6'5 respectivamente). Sin embargo, la incubación con el exudado no afectó a la digestión de la ZP que fue similar en todos los grupos sugiriendo que tanto el contenido de los GCs de ovocitos porcinos como bovinos tiene una función en el bloqueo de la polispermia en la especie porcina y que este efecto no parece deberse a un endurecimiento de la ZP. II. Se realizó un análisis de las posibles moléculas existentes en los GCs de la especie porcina. Para ello, el estudio de los GCs se abordó de distintas maneras. Por un lado, el medio de cultivo obtenido en la primera fase experimental se separó mediante electroforesis de SDS-PAGE y se analizó por proteómica, encontrando que en este medio estan presentes proteínas de menos de 40 kDa entre las que se pudieron identificar las proteasas tripsina-4 y tripsina V-A. Por otro lado estudiando glicoproteínas en los GCs que sean reconocidas por las lectinas PNA y WGA mediante microscopía electrónica de transmisión. A partir del lisado de ovocitos porcinos madurados in vitro se realizó un análisis bioquímico mediante Western-blot y proteómica de las bandas reactivas a la lectina PNA. Los resultados obtenidos muestran que las lectinas PNA y WGA tienen afinidad por componentes de los GCs y presentan una distribución heterogénea entre gránulos. En el lisado de ovocitos porcinos existen glicoproteínas con afinidad a PNA de 120, 100, 80, 65 y 55 kDa aproximadamente y, para WGA, glicoproteínas de 180 y 15 kDa aproximadamente, y una banda continua de 85 a 50 kDa aproximadamente. Mediante análisis por proteómica del lisado de ovocitos porcinos precipitado con PNA se pudieron identificar dos isoformas de la proteína chaperona Hsp-70 (Hsp-70 proteína 1 y Hsp-70 proteína 1A) y la proteína ER-60 así, como glicoproteínas de la ZP (ZP3 y ZP4). También se estudió mediante microscopía confocal la proteína ER-60 localizándose en la región cortical de los ovocitos porcinos maduros permeabilizados. Sin embargo, la proteína ER-60 no se identifica en ovocitos maduros no permeabilizados, indicando así que esta proteína no esta localizada en membrana y limitando su localización a la región cortical del ovocito. Esta inmunoreactivad se mantuvo en ovocitos fecundados permeabilizados y no permeabilizados, esto indica, que ER-60 es secretada por los GCs tras la fecundación y continua presente debido a la interacción con proteínas del oolea. Finalmente se estudió la localización de la proteína calreticulina en ovocitos porcinos. En nuestros resultados encontramos que esta proteína se localiza en la región cortical de ovocitos porcinos maduros, al igual que ER-60, pero a diferencia de ésta la inmunoreactividad para calreticulina desaparece en ovocitos fecundados, indicando así, que calreticulina es secretada por los GCs tras la fecundación. Estos resultados muestran que los GCs de los ovocitos porcinos probablemente contengan proteasas tipo tripsina, así como moléculas afines a la lectinas PNA y WGA. Por otro lado la presencia de las proteínas ER-60 y calreticulina en la región cortical de los ovocitos porcinos maduros está relacionada con los GCs. III. Se realizó un estudio de las metaloproteasas ADAM-10 y ADAM-17 en ovocitos maduros porcinos y bovinos. Se encontró que los ovocitos porcinos y bovinos maduros expresan el gen que codifica para estas metaloproteasas y, mediante inmunofluorescencia, se determinó que estan localizadas en el oolema de ovocitos de ambas especies.
