Resumen de Characterization of two metallocarboxypeptidases of M14D subfamily from bacterial and human origin
Anabel Otero Bilbao
Las metalocarboxipeptidasas (MCP) de la familia M14 catalizan la hidrólisis de aminoácidos del C-terminal de proteínas y péptidos. Nuestro grupo describió la subfamilia M14D o carboxipeptidasas citosólicas (CCP) a partir de búsquedas genómicas de secuencias aminoacídicas similares a CCP1 o Nna1 (Nervous system nuclear protein induced by axotomy, por sus siglas en Inglés). Se identificaron CCPs en cerca de 100 bacterias Gram negativas, generalmente con una única copia del gen. Las CCPs bacterianas tiene una arquitectura de dominios más simple que consiste en el dominio amino terminal (N-dominio) y el dominio carboxipeptidasa (dominio CP). En humanos hay seis genes parálogos (CCP1-CCP6) y además de los dominios N- and CP- contienen extensiones adicionales en ambos extremos. Estas proteínas son muy complejas y difíciles de manipular experimentalmente. La principal función de las CCPs de Eucariotas parece ser el procesamiento de modificaciones postraduccionales en el C-terminal de las tubulinas como las cadenas laterales de ácidos poliglutámicos o el ácido glutámico codificado en la cadena principal. La CCP1 humana además procesa los C-terminales ácidos de otras proteínas. Estos segmentos participan en interacciones moleculares y por tanto la CCP1 podría regular estas interacciones. Estudios filogenéticos y de localización intracelular sugieren que las funciones de las CCPs de Eucariotas pudieran estar relacionadas con los cilios y los cuerpos basales aunque no se conocen bien muchos de los mecanismos moleculares involucrados. Las CCPs de Procariotas han sido muy poco caracterizadas desde el punto de vista bioquímico y funcional. El presente trabajo ha aportado más información de las características estructurales y funcionales de la familia M14D, utilizando como modelos la CCP de Pseudomonas aeruginosa (PaCCP) y la CCP6 humana (hCCP6). Se determinó la estructura cristalográfica de PaCCP que tiene un novedoso dominio N-terminal tipo ?-sandwich y un dominio CP clásico tipo ?/?-hidrolasa. La mayoría de los residuos del centro activo están bien posicionados, sin embargo no se detectó actividad enzimática utilizando diferentes sustratos. Esto sugiere que PaCCP pudiera estar en una forma inactiva o que la activación requiere la presencia de su sustrato(s) específico(s) y/o un regulador alostérico. La co-cristalización de PaCCP con inhibidores de MCPs sugiere que la enzima podría necesitar un reordenamiento estructural para ser activa. La estructura de PaCCP permitió modelar las CCPs de mamíferos que conservan el plegamiento global de los dominios N- y CP- y la posición de los residuos claves. Se caracterizó una cepa de P. aeruginosa deficiente en PaCCP (?paccp) para explorar posibles mecanismos funcionales. La producción de PaCCP fue dependiente de la densidad celular sugiriendo una relación con el “Quorum Sensing” (QS). La cepa ?paccp mostró mayor actividad proteolítica extracelular y movilidad “swarming”, menor formación de biofilm y una pérdida total de la movilidad “twitching” (TM). Demostramos que la ausencia de TM se debió a bajos niveles intracelulares de PilA, la proteína estructural del pili. Se propone que PaCCP pudiera regular la expresión de pilA y posiblemente otros genes en la bacteria. La cepa ?paccp resultó ser menos virulenta en el modelo “slow killing” de C. elegans, lo que apunta a un papel de PaCCP en la patogénesis de P. aeruginosa. hCCP6 mostró la misma actividad deglutamilasa de las tubulinas que el ortólogo en ratón. La proteína actuó específicamente sobre la ?-tubulina lo que podría representar un mecanismo de regulación de las CCPs. hCCP6 hidrolizó los ácidos glutámicos en el C-terminal de la proteína TRAFD1, un sustrato de CCP1, aunque habría que determinar si es un sustrato natural. La actividad de hCCP6 es inhibida por agentes quelantes y no por inhibidores proteicos de CP. Estudios de interactómica permitieron identificar proteínas que potencialmente interactúan con PaCCP y hCCP6. Algunas se proponen para una futura validación lo que contribuirá a la mejor comprensión de las relaciones funcionales de estas enzimas.
