Studies on the oxidative ability of horse liver alcohol dehydrogenase and its cofactor regeneration

• Autores: Rossmery Anaid Rodríguez Hinestroza
• Directores de la Tesis: Maria Dolors Benaiges Massa (dir. tes.), Carmen López Díaz (dir. tes.), Josep López Santín (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat Autònoma de Barcelona ( España ) en 2014
• Idioma: inglés
• Tribunal Calificador de la Tesis: Francisco Valero Barranco (presid.), Anthony Max Cardenas Fernadez (secret.), Pere Clapés Saborit (voc.)
• Materias:
  • Ciencias tecnológicas
    • Ingeniería y tecnología químicas
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en:  TDX  DDD 
• Resumen

  • El estudio del uso de las enzimas como catalizadores industriales se ha incrementado en las últimas décadas debido a que éstas ofrecen muchas ventajas, tales como: su capacidad para aceptar un amplio rango de sustratos, su alta especificidad y selectividad y permiten el uso de condiciones suaves de operación. Uno de los campos de aplicación más prometedores es la producción de compuestos con actividad biológica para fines terapéuticos. Esta tesis doctoral es una contribución en la investigación de la enzima alcohol deshidrogenasa de hígado de caballo (HLADH) como biocatalizador, específicamente su capacidad de oxidar Cbz-aminoalcoholes para obtener compuestos de interés como Cbz-aminoaldehídos para producir Cbz-aminopolioles, y Cbz-ß-aminoácidos. Asimismo, se seleccionó la Cbz-etanolamina y el Cbz-ß-aminopropanol como compuestos modelos. Primero, se realizó un estudio de la enzima alcohol deshidrogenasa de diferente origen, como la de levadura e hígado de caballo (comercial y purificada en el laboratorio), en la oxidación de Cbz-etanolamina. Se eligió la enzima purificada en el laboratorio extraída a partir de un hígado de caballo como el mejor biocatalizador, en términos de actividad específica y parámetros cinéticos. Además, se llevó a cabo la oxidación de Cbz-etanolamina catalizada por HLADH y se observó la formación directa del ácido, Cbz-glicina. Se evaluaron diferentes métodos para promover la producción del producto intermedio (el aldehído, Cbz-glicinal), mas solamente el empleo de clorhidrato de semicarbazida permitió la obtención de Cbz-glicinal por medio de su captura como Cbz-glicinal semicarbazona, obteniéndose un rendimiento de hasta 84%, con menos de 12% de rendimiento de Cbz-glicina. La hidrólisis ácida del Cbz-glicinal semicarbazona con formaldehido proporcionó una recuperación de Cbz-glicinal de 48.5%. Sin embargo, debido a la cantidad de impurezas, principalmente formaldehido, éste no pudo ser considerado como un buen candidato para la posterior adición aldólica con dihidroxiacetona fosfato (DHAP) catalizada por aldolasas para obtener Cbz-aminopolioles (Capítulo 4). Por otra parte, no se produjeron Cbz-aminopolioles mediante el acoplamiento de la reacción de oxidación de Cbz-etanolamina por HLADH y la adición aldólica de DHAP catalizada por ramnulosa-1-fosfato aldolasa (RhuA) con pulsos de DHAP, obteniéndose solamente Cbz-glicina, con un rendimiento de 64.1% (capítulo 5). Posteriormente, se aprovechó la alta capacidad oxidativa de la enzima HLADH para producir Cbz-ß-alanina a partir de Cbz-ß-aminopropanol; se obtuvo una conversión completa del sustrato a las 72 h empleando una operación tipo batch. De manera de aumentar la productividad, se propuso la adición de pulsos de sustrato, el cual proporcionó un rendimiento de Cbz-alanina de 88.4% a las 96 h y permitió el incremento de la productividad en 2.3 veces, comparado con la operación tipo batch (capítulo 6). Finalmente, se realizó un estudio de la regeneración del cofactor NAD+ empleando métodos enzimáticos y electroquímicos. Se evaluó la regeneración enzimática por acoplamiento de sustratos utilizando acetaldehído como segundo sustrato, el cual proporcionó una conversión completa hacia ß-alanina en las primeras dos horas de reacción, con una operación tipo batch. Sin embargo, ésta no fue tan eficiente al añadir pulsos de sustrato (se obtuvo 65% de conversión a las 2 h y solamente pudo añadirse un pulso) y la reacción se detuvo a las 2 h (capítulo 6). Se realizó una regeneración electroquímica directa del cofactor NAD+ empleando un microreactor tipo filtro prensa, mediante el acoplamiento con la reacción de oxidación de Cbz-ß-aminopropanol para la producción de Cbz-ß-alanina. Se obtuvo una conversión de Cbz-ß-aminopropanol de 77.1% y una regeneración completa del cofactor a las 24 h con una operación tipo batch. Mientras tanto, se observó una conversión de alrededor 80% y una regeneración de la mitad de la cantidad inicial de cofactor a las 51 h, empleando una operación tipo batch con pulsos de Cbz-ß-aminopropanol (capítulo 7).