Estudio de la nucleasa EndoG en el protozoo "Leishmania infantum": caracterización e implicaciones en la supervivencia y muerte del parásito
- Autores: Eva Rico Vidal
- Directores de la Tesis: Antonio Jiménez Ruiz (dir. tes.), Federico Gago Badenas (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Alcalá ( España ) en 2010
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: M. Josefa Toro Nozal (presid.), Antonio Chiloeches Gálvez (secret.), Ger van Zandbergen (voc.), Nicolas Fasel (voc.), Víctor Manuel González Muñoz (voc.)
- Materias:
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- Tesis en acceso abierto en: e_Buah
- Resumen
- español
En los últimos años, ha sido demostrado y aceptado que organismos unicelulares como los parasitos del género Leishmania son susceptibles de sufrir procesos de muerte celular que recuerdan a la apoptosis descrita en metazoos, y que pueden ser inducidos por una amplia variedad de estímulos. Sin embargo, los mecanismos moleculares que participan y regulan este proceso todavía son bastante desconocidos y se han descrito pobremente. Además, las moléculas que podrían participar en dichos procesos todavía no han sido identificadas. Debido a que la degradación del ADN es probablemente el evento más caracterizado durante el proceso similar a apoptosis que tiene lugar en Leishmania, nos hemos centrado en identificar a la nucleasa responsable de dicha degradación. Los resultados presentados en esta tesis demuestran que los promastigotes de Leishmania infantum expresan una nucleasa similar a las Endonucleasas G de eucariotas superiores que, de acuerdo con la predicción para su estructura, pertenece a la superfamilia de nucleasas con dominio ßß¿ de unión a metal. El pH óptimo y los requerimientos catiónicos de la EndoG de L. infantum recuerdan a los determinados previamente para otras EndoGs. Además, la nucleasa del parásito procesa cada hebra de ADN de forma independiente, al igual que se ha descrito para sus homólogas en otros organismos, y muestra, al igual que la nucleasa Nuc1p de levaduras, actividad endo-exonucleasa. La actividad de la proteína recombinante puede ser además inhibida por la acción del ácido aurín-tricarboxílico (ATA), que es un clásico inhibidor de nucleasas, y por el agente reductor ß-mercaptoetanol. Este último resultado se debe probablemente a la presencia de un puente disulfuro entre los residuos de cisteína 100 y 116. La actividad de esta nucleasa se puede inhibir también por la acción del análogo de timidina LEI-49, que muestra una mayor actividad anti-Leishmania frente a parásitos que sobre-expresan EndoG que frente a parásitos silvestres. La EndoG de L. infantum contiene un péptido señal que causa su translocación a la mitocondria, donde se localiza en condiciones normales de crecimiento. Sin embargo, ante un estímulo de muerte como el tratamiento de los parásitos con edelfosina o miltefosina, la nucleasa es liberada de la mitocondria y se transloca hasta el núcleo, donde interviene en la degradación del ADN que tiene lugar durante el proceso apoptótico. Nuestros resultados también demuestran que la sobre-expresión de la proteína en parásitos tratados con edelfosina o miltefosina, causa un incremento significativo en el porcentaje de parásitos TUNEL positivos, pero no conlleva ningún efecto en condiciones normales de crecimiento. Por otro lado, parásitos que expresan niveles de proteína más bajos de lo normal crecen en menor medida que los parásitos silvestres y son más resistentes ante un estímulo de muerte, produciéndose una disminución del porcentaje de parásitos TUNEL positivos tras tratamiento con edelfosina con respecto a los parásitos silvestres. Análisis mutacionales revelan que los aminoácidos presentes en el centro catalítico de la nucleasa tienen diversa relevancia en su actividad catalítica. Así, mientras que la H214 y la R212 parecen fundamentales para la actividad de la enzima debido al papel que desempeñan en el ataque nucleófilo y en el reconocimiento de sustrato, respectivamente, la S211 no parece ser fundamental para la correcta arquitectura del sitio catalítico. Finalmente, hemos identificado un dominio putativo de auto-inhibición en la EndoG de L. infantum, que podría estar implicado en la regulación de la actividad catalítica de la misma.
- English
It is increasingly accepted that single-celled organisms, such as Leishmania parasites, are able to undergo a cell death process that resembles apoptosis in metazoans and is induced by a variety of stimuli. However, the molecular mechanisms that participate and regulate this death process are still very poorly described, and very few of the participating molecules have been identified. Because DNA degradation is probably the most frequently characterized event during programmed cell death in Leishmania parasites, we have focused on identifying a candidate nuclease responsible for this effect during the cell death process. The results presented in this thesis demonstrate that Leishmania infantum promastigotes express a nuclease similar to the Endonuclease G of higher eukaryotes which, according to its predicted structure, belongs to the ββα-metal superfamily of nucleases. Its optimal pH and its cation dependence resembles that of EndoGs present in other organisms and, similarly to them, it is inhibited by moderate concentrations of K+, Na+ and Ca+2. Moreover, L. infantum nuclease processes each DNA strand independently, as described for other Endonucleases G, and shows, like yeast Nuc1p, endo-exonuclease activity. The activity of the recombinant protein can be inhibited by addition of the general nuclease inhibitor aurintricarboxylic acid (ATA) or the reducing agent β-mercaptoethanol. This latter result is probably due to the presence of a disulfide bound between Cys100 and Cys116 that appears to be crucial for the nuclease activity. This activity can also be inhibited by the synthetic thymidine analogue LEI-49, which also shows higher anti-Leishmania activity against wild-type parasites than against parasites overexpressing EndoG. L. infantum EndoG contains a signal peptide that causes its translocation to the mitochondrion where it is maintained under normal growth conditions. However, under the pressure of a death stimulus such as edelfosine or miltefosine treatment, L. infantum EndoG is released from the single mitochondrion and translocates to the nucleus, where it is thought to participate in the process of DNA degradation that is associated with an apoptotic process. Our results also demonstrate that overexpression of the nuclease in edelfosine- and miltefosine-treated promastigotes causes a significant increase in the percentage of TUNEL-positive parasites, whilst this overexpression has no effect on the normal growth of the parasites. On the other hand, parasites expressing low levels of the protein grow at a lower rate than do wild-type parasites under healthy growth conditions, and show a higher resistance to death than wild-type parasites under a cell-death stimulus, as revealed by the decrease in the percentage of TUNEL-positive parasites treated with edelfosine. Mutation analysis reveals that the amino acids present in the catalytic center of the nuclease are not equally relevant for the nuclease activity. Thus, His214 and Arg212 are crucial because they are involved in the catalytic mechanism and in substrate recognition, respectively, whereas Ser211 is not. Finally, we have identified a putative inhibitory domain in L. infantum EndoG that could be playing a regulatory role in the catalytic activity of this important enzyme.
- español
