El mecanisme de vigilància de la fase S estabilitza els nivells de la ciclina Clb6 en resposta a estrès genotòxic

• Autores: Glòria Palou Marín
• Directores de la Tesis: David García i Quintana (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat Autònoma de Barcelona ( España ) en 2009
• Idioma: catalán
• Tribunal Calificador de la Tesis: Martí Aldea Malo (presid.), Antonio Casamayor Gracia (secret.), Ethelvina Queralt Badía (voc.)
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Biología celular
    • Biología molecular
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en:  TDX  DDD 
• Resumen

  • Les cèl·lules eucariotes estan constantment exposades a dany al DNA i a estrès replicatiu (estrès genotòxic), font d'inestabilitat genòmica. L'anomenat mecanisme de vigilància (checkpoint) de la fase S detecta la presència d'estrès genotòxic i genera una resposta que inclou l'aturada preventiva de la replicació i del cicle cel·lular, per tal de donar temps a la superació del problema, i la protecció de la replicació dels cromosomes. Quan els elements centrals d'aquest mecanisme de control estan mutants, les cèl·lules esdevenen genèticament inestables i, en humans, predisposa al càncer. Malgrat el seu paper crític en la preservació de la integritat del genoma, es desconeix la manera com el mecanisme de vigilància de la fase S executa bona part de la seva resposta. Els elements i vies que constitueixen el checkpoint estan conservats evolutivament. El nostre treball s'ha centrat en el llevat de gemmació Saccharomyces cerevisiae. En aquest organisme la proteïna quinasa efectora principal és Rad53. Amb l'objectiu de descobrir dianes a través de les quals Rad53 regula la fase S, s'han assajat en una reacció quinasa in vitro diferents proteïnes candidates a ser substrat de Rad53. Això ha permès la identificació de la ciclina de fase S Clb6 com a substrat de Rad53 in vitro.Les ciclines són les subunitats activadores de la quinasa dependent de ciclina Cdc28/Cdk1, que promou la progressió del cicle cel·lular. Cdc28/Cdk1 és activada per diferents ciclines específiques de les diferents fases del cicle cel·lular, que li confereixen especificitat de substrat. Clb6 és una de les dues ciclines de fase S (junt amb Clb5), que promouen la replicació del DNA. Mentre que Clb5 és present des del final de la fase G1 fins a anafase, Clb6 és eliminada durant la primera meitat de la fase S. Per tal d'estudiar si Clb6 és diana de Rad53 in vivo, s'ha estudiat el seu comportament en resposta a estrès genotòxic. Interessantment, en una fase S compromesa els nivells de Clb6 es mantenen estables, i aquesta estabilització és dependent de Rad53. Experiments amb l'inhibidor de la traducció proteica cicloheximida mostren que l'estabilització de Clb6 requereix síntesi de novo. Donat que en un cicle cel·lular no pertorbat Clb6 és expressada exclusivament en fase G1, sota el control del factor de transcripció MBF. Els nostres resultats indiquen que MBF es reactiva en una fase S compromesa: la subunitat transactivadora Swi6, exclosa del nucli en una fase S no pertorbada, és nuclear en una fase S compromesa; per altra banda, la sobreexpressió d'una forma hiperestable del repressor d'MBF Nrm1 dóna lloc a la desaparició de Clb6 malgrat la presència continuada d'estrès genotòxic i una resposta checkpoint funcional. Fins ara MBF era considerat un factor de transcripció exclusiu de la fase G1.Per últim hem explorat el paper de l'estabilització de Clb6 en una fase S compromesa. El mutant nul clb6 no presenta cap fenotip detectable, suggerint que Clb6 pot operar en forma redundant dins de la resposta a estrès genotòxic. Per aquest motiu hem optat pel plantejament complementari: estudiar l'efecte de mantenir la presència de Clb6 en una fase S no pertorbada (i per tant en absència de la resta de la resposta checkpoint). En aquestes condicions les cèl·lules repliquen el seu DNA amb aparent normalitat, però queden aturades en un estadi previ a anafase. Aquests resultats suggereixen que Clb6 pot ser un element efector de la branca S-M del mecanisme de vigilància de la fase S, que estaria constituïda per diversos punts de control solapat. Aquest paper justificaria que Clb6 hagi de ser eliminada de forma avançada respecte a Clb5.