Estrategias celulares y moleculares en el cribado de nuevos agentes anti-Leishmania
- Autores: David Moreno Mateos
- Directores de la Tesis: Antonio Jiménez Ruiz (dir. tes.), Federico Gago Badenas (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Alcalá ( España ) en 2010
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Miguel Angel Pérez Albarsanz (presid.), Antonio Chiloeches Gálvez (secret.), María Begoña García Álvarez (voc.), Vicente Larraga Rodríguez de Vera (voc.), Dolores González Pacanowska (voc.)
- Calificación: Sobresaliente Cum Laude
- Materias:
- Enlaces
- Resumen
- español
El tratamiento de las enfermedades parasitarias producidas por los tripanosomátidos requiere el desarrollo de nuevos agentes que conlleven más selectividad y un mejor perfil farmacológico que los actualmente existentes. Afrontamos este desafío utilizando dos estrategias distintas. En primer lugar, dado que algunos nuevos fármacos se descubren por simple azar, mediante la evaluación de amplias librerías químicas, decidimos implementar un cribado de alto rendimiento que nos permitiría determinar su citotoxicidad en promastigotes y amastigotes de Leishmania, así como en dos líneas humanas (Jurkat y THP-1). Empleando este método de cribado, evaluamos más de 160 compuestos. El resultado en el tratamiento de células THP-1 infectadas con amastigotes fue de siete hits, cuatro de ellos comparables o incluso con mejor actividad que edelfosina, fármaco leishmanicida estándar. Así, estos derivados representan nuevas cabezas de serie para realizar estudios con más profundidad dirigidos a establecer su mecanismo de acción. Por otra parte, perseguimos una innovadora aproximación en el tratamiento de la leishmaniasis, consistente en la inhibición de la dimerización de la enzima tripanotión reductasa (TryR), una flavoenzima homodimérica esencial y única para los parásitos kinetoplastos, como son Trypanosoma, responsable de la enfermedad de Chagas y la enfermedad del sueño, así como Leishmania, responsable de las leishmaniasis cutánea y visceral. Se piensa que la TryR es la enzima central en el metabolismo redox de estos protozoos dado que es la única que acopla la transferencia de equivalentes de reducción de la pareja NADP+/NADPH a las especies con tioles. Mediante estudios computacionales basados en estructura, encontramos los puntos calientes o hot-spots presentes en la superficie de dimerización y responsables, presumiblemente, de la mayor parte de la afinidad intermolecular. Utilizando técnicas de biología molecular, bioquímica y de estudio de la oligomerización, encontramos que el glutámico 436 (E436), uno de los tres candidatos iniciales identificado como un hot-spot putativo, es un residuo clave en la dimerización de la TryR. Basándonos en estos hallazgos, diseñamos un péptido que inhibe tanto la dimerización como la actividad de la TryR. Además, demostramos que este péptido presenta una actividad leishmanicida en macrófagos humanos infectados con amastigotes. Por último, presentamos algunos resultados que sugieren la existencia de un sensor biológico en la TryR de los tripanosomátidos, que les permitiría detectar un ataque oxidante y reaccionar frente al mismo. En resumen, en el presente trabajo se muestran dos distintas aproximaciones dirigidas a cubrir la necesidad de desarrollar nuevos fármacos eficientes y seguros para el tratamiento de la leishmaniasis.
- English
Treatment of parasitic diseases caused by trypanosomatids requires the development of new agents endowed with both more selectivity and a pharmacological profile that is improved over that of currently used agents. We face this challenge by following two different strategies. On the one hand, as new drugs are often discovered serendipitously by testing large chemical libraries, we decided to implement an in‐house high‐throughput screening (HTS) that will enable us to test cytotoxicity both on Leishmania promastigotes/amastigotes and two different human cell lines (Jurkat and THP‐1). Using this HTS method we tested more than 160 compounds. The outcome in the treatment of amastigote‐infected THP‐1 cells was seven hits, four of them of comparable or even better activity than edelfosine, a reference standard antileishmanial drug. These derivatives thus represent new leads for further studies aimed at establishing their mechanism of action. On the other hand, we pursued an innovative approach in the treatment of leishmaniasis consisting of inhibiting the dimerization of the enzyme trypanothione reductase (TryR), an essential homodimeric flavoenzyme unique to kinetoplastid parasites including Trypanosoma, responsible for Chagas disease and sleeping sickness, and Leishmania, responsible for cutaneous and visceral leishmaniasis. TryR is thought to be the central enzyme in the redox metabolism of these protozoans because it alone couples the transfer of reducing equivalents from the NADP+/NADPH pair to thiol‐containing species. By means of structure‐based computational studies we found the hot‐spots in the dimeric interface presumably responsible for the largest part of the intermolecular affinity. Using molecular biology, biochemistry and oligomerization detection techniques, we have found that glutamic 436 (E436), one of the three initial candidates identified as putative hot‐spots, is a key residue for TryR dimerization. On the basis of these findings we then designed a peptide that inhibits both TryR dimerization and activity. Furthermore, we proved that this peptide has leishmanicidal activity on amastigote‐infected human macrophages. We also prensent some results suggestive of the existence of a biological sensor in the trypanosomatids’ TryR that allows them to detect an oxidative burst and react facing it. To sum up, herein we show two different approaches aimed at fulfilling the need to develop new, efficient and safe drugs for the treatment of leishmaniasis.
- español
