Estudi de les vies del TNF/TNFR2 i del CD200/CD200R en el rebuig xenogènic

• Autores: Mireia Uribe Herranz
• Directores de la Tesis: Enric Espel Masferrer (dir. tes.), Cristina Costa Vallès (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2010
• Idioma: catalán
• Tribunal Calificador de la Tesis: Lisardo Boscá Gomar (presid.), Francisco Lozano Soto (secret.), María Montoya González (voc.)
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Inmunología
      • Trasplante de órganos
    • Biología molecular
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en:  TDX  Dipòsit Digital de la UB 
• Resumen

  • Les aplicacions xenogèniques podrien anar des del xenotrasplantament d'òrgans sòlids, a l'empelt de teixits o cèl·lules. El principal obstacle per a la seva aplicació és la forta resposta immunitària generada pel xenoempelt, mediada tant per mecanismes cel·lulars com humorals. Diverses vies de senyalització i molècules estan relacionades amb aquest rebuig. En aquest treball s'estudien la via del TNF/TNFR i del CD200/CD200R. El TNFα s'uneix específicament a dos receptors, el TNFR1 i el TNFR2. Diferents estudis han demostrat la seva implicació en el rebuig agut de l'empelt xenogènic. En aquest treball s'ha identificat i caracteritzat diverses variants del TNFR2 porcí generades a partir de dos tipus diferents de splicings. El primer, provoca la deleció de l'exó 4, per homologia amb la seqüència humana. El segon engloba el que correspondria per homologia als exons 7 al 10 humans i provoca que la predicció de la proteïna resultant sigui soluble. En els experiments de PCR en temps real es va detectar els dos tipus de splicing a nivell de RNA en tots els teixits analitzats. Els nivells globals més elevats els trobem en cèl·lules del sistema immunitari com els PBMC o els monòcits aïllats i en òrgans com la melsa i el pulmó. La determinació de les diferents variants per separat mostren com els dos tipus de splicings són més abundants en monòcits aïllats o PBMC. Els estudis de localització subcel·lular ens van permetre identificar dos patrons d'expressió diferents. Per una banda el pTNFR2 té un marcat patró membranal. En canvi, la isoforma que conté el splicing a l'exó 4 és totalment intracel·lular, amb una alta colocalització amb el reticle endoplasmàtic. Tot i així els estudis realitzats amb la tècnica de FRET, han posat de relleu la interacció entre pTNFR2 i pTNFR2ΔE4 en l'espai intracel·lular. Els receptors de TNF formen homotrímers per ser funcionals, en aquest treball també hem demostrat que les proteïnes solubles són capaces de combinar-se entre elles de forma específica i que aquesta combinació és funcional. El CD200 regula l'activitat de les cèl·lules mieloides a través de la interacció amb el seu receptor. Diferents estudis han descrit el paper immunoregulador de la interacció CD200-CD200R en el control del rebuig de l'al·lotrasplantament i del xenotrasplantament concordant. La segona part d'aquesta tesi està dedicada a la identificació i caracterització del CD200 i CD200R porcins. Els resultats obtinguts identifiquen, per primera vegada, el CD200 porcí i tres variants del seu receptor. Una anàlisi bioinformàtica va permetre caracteritzar la molècula i comprovar que té un patró molt similar al descrit pel CD200 d'altres espècies, dos dominis d'immunoglobulines, una transmembrana i una regió citosòlica curta sense motius senyalitzadors coneguts. La primera variant de receptor pCD200R1, té una homologia elevada amb la variant a del receptor humà. La primera i segona variant soluble, el pCD200R2 i pCD200R3, contenen un canvi en el marc de lectura i que fa aparèixer un codó de stop primerenc, just abans de la zona de transmembrana. El receptor porcí té els tres llocs d'unió a CD200 més crítics conservats. Gràcies a la tecnologia de la ressonància de plasmó de superfície, vam determinar que les constant d'afinitats entre CD200-CD200R estan al voltant de 10-7 i 10-8 M tan en sistemes al·logènics com xenogènics. Amb la finalitat d'identificar les proteïnes porcines del CD200 i del seu receptor, es van generar antipèptids i es van produir anticossos policlonals en conills útils tan en anàlisi de Western Blot com per citometria de flux. Els experiments de PCR en temps real van determinar i quantificar l'expressió del CD200 porcí. Els resultat van confirmar que està àmpliament distribuït per diferents teixits i tipus cel·lulars