Estudio de las proteínas de la partícula regulatoria del proteosoma y del ensamblaje de la lid y análisis estructural del dominio OBD de RepB y su unión al ADN

• Autores: Juliana Amodio Debenjak
• Directores de la Tesis: Miquel Coll Capella (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat de Barcelona ( España ) en 2014
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Ignacio Fita Rodríguez (presid.), Albert Canals Parera (secret.), Bernat Crosas Navarro (voc.)
• Materias:
  • Física
    • Física del estado sólido
      • Cristalografía
  • Química
    • Bioquímica
      • Biología molecular
      • Proteínas
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en:  TDX  Dipòsit Digital de la UB 
• Resumen

  • La tesis titulada ¿Estudio de las proteínas de la partícula regulatoria del proteosoma y del ensamblaje de la lid y análisis estructural del dominio OBD de RepB y su unión al ADN¿ consta de dos proyectos. Estudio de las proteínas de la partícula regulatoria del proteosoma y del ensamblaje de la lid El sistema ubiquitina-proteosoma es la mayor ruta proteolítica citosólica en eucariotas, controla casi todos los procesos celulares básicos degradando las proteínas unidas a una cadena de ubiquitinas. El sistema se compone de una cascada de ligasas de ubiquitina que conjugan la ubiquitina a las proteínas diana y el proteosoma responsable de la degradación de dichas proteínas. El proteosoma 26S presente en eucariotas se puede dividir en dos complejos: la partícula central (20S) y la partícula regulatoria (19S), a su vez la partícula regulatoria puedo dividirse en dos subcomplejos: la base y la lid. En este proyecto se realizó el clonaje, expresión heteróloga y purificación de todas las proteínas Rpn de la lid y tres de la base (Rpn1, 2 y 10) de Saccharomyces cerevisiae en Escherichia coli. Las proteínas se expresaron individualmente y en conjunto (mediante la co-expresión y/o co-lisis). Estos experimentos resultaron en una amplia variedad de subcomplejos, desde complejos de dos proteínas hasta cinco y el reemplazo de algunas subunidades por versiones truncadas proporcionó información sobre áreas discretas de interacción entre proteínas, permitiendo crear un modelo de interacciones intermoleculares dentro del complejo de la lid. Además tres de los complejos obtenidos (Rpn5/8/9, Rpn5/8/9/11 y Rpn5/6/8/9/11) se analizaron mediante microscopia electrónica (EM) proporcionando una visión de los eventos biogénicos de la lid, ya que representan la adición consecutiva de subunidades. Análisis estructural del dominio OBD de RepB y su unión al ADN El plásmido de amplio espectro pMV158 se replica mediante el mecanismo de círculo rodante. Su proteína de iniciación de la replicación es RepB, la cual reconoce y corta el ADN en un sitio específico. En un trabajo previo realizado en nuestro laboratorio se resolvió la estructura tridimensional de esta proteína full length, demostrando su naturaleza hexamérica. Cada monómero de RepB se compone de dos dominios: el OBD (origin-binding domain) responsable del reconocimiento del sitio de corte y el OD (oligomerization domain) que se unen entre si formando el hexámero. En este trabajo se cristalizó y resolvió mediante reemplazo molecular la estructura del OBD de RepB unido a su ADN diana, un oligonucleótido de 23bp que aloja parte de la secuencia del sitio de unión al ADN. La estructura nos permitió analizar la interacción específica proteína/ADN, la cual se establece en el surco mayor, pudiendo identificar los aminoácidos que interaccionan con áreas discretas en el ADN, siendo estos resultados comparables con aquellos descritos con anterioridad en la literatura mediante otras técnicas como mutaciones puntuales o estudios de fingerprinting. A su vez generamos un modelo que explica el modo de acción de RepB a la hora de reconocer el sitio de corte en su condición hexamérica.