Novel Modes of Regulation of Cyclin Dependent Kinase Cdk1
- Autores: Fanli Zeng
- Directores de la Tesis: David García i Quintana (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat Autònoma de Barcelona ( España ) en 2014
- Idioma: inglés
- Tribunal Calificador de la Tesis: Josep Clotet (presid.), José Ramon Bayascas Ramírez (secret.), Francisco Ferrezuelo Muñoz (voc.)
- Materias:
- Enlaces
- Resumen
Les quinases dependents de ciclina (CDKs) dirigeixen la progressió del cicle cel·lular a les cèl·lules eucariotes. A l’organisme eucariota model Saccharomyces cerevisiae (llevat de gemmació) una sola quinasa dependent de ciclina, Cdk1, és essencial i suficient per dirigir el cicle cel·lular. Unida alternativament a ciclines de fase G1, S i G2/M, Cdk1 regula els programes transcripcionals del cicle cel·lular, la replicació i segregació dels cromosomes, la dinàmica del fus mitòtic, el creixement cel·lular polar, la morfogènesi, etc. La desregulació de l’activitat CDK promou la proliferació descontrolada i la inestabilitat genòmica. Donada la seva funció essencial en la progressió del cicle cel·lular, Cdk1 és estretament regulada per proteïnes associades (les ciclines, Cks1, i inhibidors de les CDKs –CKIs) i per modificacions post-traduccionals. Tanmateix, molts detalls de la regulació de Cdk1 romanen desconeguts, com és el cas de com les activitats CDK de fase G1 o de fase M són inhibides en resposta a determinats estressos cel·lulars. Quan la progressió del cicle cel·lular és amenaçada per la presència d’estressos genotòxics tals com l’estrès replicatiu o la presència de dany al DNA, un mecanisme de vigilància, l’anomenat checkpoint de la fase S, s’activa per tal de protegir la integritat del genoma. Al llevat de gemmació, el checkpoint de la fase S és mediat per la quinasa Mec1 (ATR/ATM a humans) i la seva quinasa efectora Rad53 (Chk2 a humans). Per explorar si la quinasa efectora Rad53 regula Cdk1 en resposta a estrès genotòxic, hem explorat dues qu?estions principals: (1) la fosforilació de Cdk1 per Rad53 i (2) la regulació per Rad53 de proteïnes associades a Cdk1. Pel que fa a la primera qu?estió, aprofitant un assaig quinasa in vitro amb Rad53, mostrem que Cdk1 és fosforilat directament per Rad53. Hem identificat proteòmicament dos llocs de Cdk1 (Ser46, Ser258) fosforilats per Rad53 in vitro. Les cèl·lules dirigides per l’al·lel no-fosforilable (Cdk1-2A) mostren un fenotip wee, compatible amb una activitat CDK incrementada/desregulada. Les cèl·lules dirigides per l’al·lel fosfomimètic (Cdk1-2E) són allargades i més grans que les cèl·lules silvestres, compatible amb una activitat CDK reduïda. A més, assignem i quantifiquem les diferents formes fosforilades de Cdk1 in vivo mitjançant electroforesi Phos-tag. Respecte la segona qu?estió, hem identificat proteòmicament proteïnes associades a Cdk1 en presència d’estrès replicatiu en forma dependent de Rad53. Hem estudiat en detall el producte del gen de funció desconeguda YPL014W, que bategem Cip1 (per Cdk1 Interacting Protein 1), que obté la puntuació més alta en l’anàlisi. Les nostres dades mostren que Cip1 és una proteïna regulada al llarg del cicle cel·lular. A més, l’abundància de Cip1 s’incrementa en forma dependent de Rad53 en presència d’estrès replicatiu. La sobre-expressió de Cip1 bloqueja les cèl·lules a fase G1 i estabilitza el CKI de fase S Sic1 in vivo. A més, Cip1 interacciona específicament amb el complex de fase G1 Cln2-Cdk1, però no amb el complex de fase S Clb5-Cdk1 or el de fase M Clb2-Cdk1. Cip1 inhibeix l’activitat Cln2-CDK tant in vivo com in vitro. Els nostres resultats suggereixen que Cip1 pot ser un nou CKI de l’activitat CDK de fase G1.
