Identificación y análisis funcional de variaciones de la secuencia del Gen FOXC1 en glaucoma congénito primario

• Autores: Cristina Medina Trillo
• Directores de la Tesis: Julio Escribano Martínez (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de Castilla-La Mancha ( España ) en 2014
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Ramón Varón Castellanos (presid.), José Martín Nieto (secret.), José María Millán Salvador (voc.)
• Calificación: Sobresaliente Cum Laude
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Biología vegetal (botánica)
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: RUIdeRA
• Resumen

  • El glaucoma congénito primario (GCP) es una enfermedad ocular grave y poco frecuente, producida por un desarrollo anómalo del ángulo iridocorneal. Ello origina la obstrucción del drenaje del humor acuoso y la elevación de la presión intraocular (PIO), que conduce a la lesión irreversible del nervio óptico. La enfermedad puede llegar a producir ceguera si no es tratada a tiempo. Las bases genéticas y moleculares de la patología no son todavía bien conocidas. Se han descrito casos de herencia recesiva, de herencia dominante y también esporádicos, con una incidencia de aproximadamente 1:10.000-1:30.000 nacimientos en poblaciones occidentales. Se conocen 3 loci (1p36, 2p22.2 y 14q24), y dos genes (CYP1B1 y LTBP2, localizados en 2p22.2 y 14q24.3, respectivamente) implicados en este tipo de glaucoma. CYP1B1 origina la enfermedad en un porcentaje variable de los pacientes, que puede oscilar entre el 10% y el 50% según las poblaciones. LTBP2 sólo es responsable de la patología en un pequeño número de familias paquistaníes. También se ha descrito la presencia de mutaciones del gen FOXC1 en un porcentaje reducido de pacientes indios. Por lo tanto, las causas genéticas de esta enfermedad permanecen desconocidas en la mayor parte de los casos. El objetivo principal de este trabajo ha sido identificar variaciones de la secuencia del gen FOXC1 en pacientes con glaucoma congénito primario (0-3 años) y en pacientes con glaucoma de inicio temprano (GIT) (4-35 años) para analizar su relación con la enfermedad. Se rastreó el gen mediante secuenciación por el método de Sanger en 133 familias afectadas de GCP y en 16 familias afectadas de GIT en las que se había descartado la existencia de mutaciones en los genes CYP1B1 y MYOC que pudieran explicar la enfermedad. Además, se analizó el posible papel como factor de riesgo genético de algunas variantes de secuencia que no mostraban una segregación mendeliana. Para ello, se realizó un estudio de casos y controles en el que se analizaron un total de 133 casos índice que presentaban GCP y 233 individuos control. Con la finalidad de evaluar el defecto funcional de las variantes identificadas en los pacientes, éstas fueron clonadas y expresadas transitoriamente en una línea celular humana (HEK-293T) y se analizó su efecto sobre la actividad transcripcional, capacidad de unión al ADN, estabilidad de la proteína o del ARNm y traducción. Se detectaron 9 mutaciones raras en heterocigosis en 14 probandos diagnosticados con GCP (10,5%). Cuatro de ellas (c.-430G>C, p.Y47X, p.G379fsX144 y p.H446_G447insGD) no habían sido descritas previamente. Las mutaciones p.Y47X, p.Q106X, p.I126S-c.2396A>T y p.H446_G447insGD han sido identificadas en 3 familias con glaucoma de herencia dominante y expresividad variable (2,25%). Las variantes p.P297S, c.-430G>C, c.-244C>T, p.G379fsX144 y c.2396A>T se detectaron en 10 casos de GCP con una herencia no mendeliana (7,5%) y han mostrado una menor alteración de la transcripción que las variantes dominantes. La mayor parte de las mutaciones afectan a la región codificante del gen y predicen cambios de aminoácidos, inserciones y deleciones que perturban a aminoácidos y regiones de la proteína evolutivamente muy conservadas, lo que apoya su patogenicidad. Los ensayos funcionales revelaron una disminución de la actividad transcripcional de aproximadamente un 40% para los mutantes p.I126S y p.P297S (alelos hipomorfos). Las mutaciones raras p.Y47X, p.Q106X y p.G379fsX144 mostraron un incremento de la actividad transcripcional de casi el 200%, por lo que se clasificaron como variantes hipermorfas. El polimorfismo p.GD447dup presentó una actividad transcripcional de aproximadamente el 160% de la forma silvestre. Estos datos apoyan la patogenicidad de las tres variantes. Según los datos disponibles, esta es la primera descripción de alelos hipermorfos del gen FOXC1. Tres de las mutaciones raras (c.-430C>G, c.-244C>T, c. 2396A>T) se localizaron en regiones reguladoras no traducidas (UTR). Los análisis bioinformáticos y funcionales revelaron que las variantes c.-430C>G y c.2396A>T alteran dos secuencias que potencialmente pueden tener un efecto regulador negativo sobre la traducción del ARNm de FOXC1, una secuencia de oligopirimidinas terminales (TOP, Terminal Oligo-Pyrimidine) y una diana reconocida por el hsa-miR-548l, respectivamente. Las dos mutaciones produjeron un aumento de la traducción del ARNm, incrementando la cantidad de proteína y por tanto su actividad, por ello también han sido consideradas variantes hipermorfas. Estos datos, revelan por primera vez la existencia de secuencias reguladoras de la traducción en las regiones UTR de FOXC1. Se han identificado tres familias con GCP no dominante (2,25%) (GCP84, GCP111 y GCP104) en las que el estudio de segregación indica una posible herencia digénica, debida a mutaciones del gen FOXC1 en combinación con mutaciones de los genes PITX2, BMP4 o CYP1B1. Finalmente, mediante estudios de asociación se demostró que las frecuencias alélicas y genotípicas del polimorfismo p.G447dup eran significativamente mayores en los pacientes con glaucoma respecto a los individuos control (13,9% vs 21,2%, respectivamente; p=0,015; O.R.=1,63; IC 95%= 1,08-2,56). Los estudios funcionales mostraron que este polimorfismo presenta una mayor actividad transcripcional (138%) comparado con la proteína silvestre. Estos datos sugieren que la variante p.G447dup constituye un factor de riesgo de GCP. Además, la presencia del polimorfismo cosegregando con mutaciones en raras de FOXC1 o CYP1B1 (familias GCP68 y GCP84 respectivamente) nos permiten proponer que la herencia conjunta de este polimorfismo con una variante hipermorfa de FOXC1 anticiparía la edad de aparición del glaucoma, mientras que en combinación con un genotipo nulo para CYP1B1 podría agravar el fenotipo dando lugar al síndrome de Axenfeld-Rieger. En conclusión, los resultados obtenidos muestran que las mutaciones, tanto hipermorfas como hipomorfas, del gen FOXC1 tienen un papel relevante en el desarrollo del GCP en población española. La actividad de la proteína FOXC1 es un factor importante que influye en la amplia variabilidad fenotípica relacionada con este gen. Además, los datos obtenidos también revelan por primera vez la existencia de secuencias reguladoras de la traducción del ARNm de FOXC1, cuya alteración puede contribuir al desarrollo de la enfermedad. Estos hallazgos contribuyen a desentrañar la base genética del glaucoma, facilitando el diagnóstico precoz, el asesoramiento genético y la identificación de posibles dianas terapéuticas.