Estudi del mecanisme d'autoregulació del gen Trl i caracterització funcional a nivell global del factor GAGA en cèl·lules S2 de Drosophila melanogaster

• Autores: David Piñeyro Valerio
• Directores de la Tesis: Jordi Bernués Martínez (dir. tes.)
• Lectura: En la Universitat Autònoma de Barcelona ( España ) en 2009
• Idioma: catalán
• Tribunal Calificador de la Tesis: Verónica Noé Mata (presid.), Inmaculada Ponte Marull (secret.), David Martín Casacuberta (voc.)
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Biología molecular
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en:  TDX  DDD 
• Resumen

  • En aquest treball hem aprofundit en l'estudi del factor de transcripció GAGA de Drosophila melanogaster, codificat pel gen Trithorax-like (Trl). GAGA s'uneix al DNA per seqüències de tipus d(GA)n, presents a moltes regions reguladores. Ja inicialment es va comprovar que és un factor essencial, que activa multitud de gens. Tot i així, també s'ha vist que reprimeix l'expressió del gen que la codifica, Trl. En aquest treball hem fet especial èmfasi en l'estudi d'aquest mecanisme d'autoregulació negativa. A més, també hem realitzat un estudi funcional global de GAGA en cèl·lules, per tal d'identificar els processos en que hi podria participar.Per mitjà d'assajos a sistemes cel·lulars heteròlegs, hem conclòs que l'autoregulació negativa de Trl està conservada entre D. melanogaster i D. virilis, però no així a cèl·lules HeLa humanes, on lluny de reprimir, GAGA activa Trl. Partint de la idea de que ha d'existir algun element a la seqüència del promotor de Trl que determini aquesta autoregulació, hem buscat aquest element emprant diverses estratègies i metodologies. Tot i que no hem aconseguit definir exactament les regions imprescindibles per a la repressió, pels nostres resultats proposem que GAGA actuaria desplaçant a un activador més potent del promotor de Trl, resultant en una davallada de l'activitat transcripcional. Alternativament, també podria ser que existís algun factor repressor que actués juntament amb GAGA per a reprimir Trl. En aquest sentit, hem analitzat la contribució d'altres factors de transcripció al mecanisme de repressió. D'aquests, només dCtBP ha mostrat una certa activitat repressora de Trl, encara que probablement per un mecanisme independent de GAGA. D'altra banda, hem analitzat la contribució de les diferents regions de GAGA al mecanisme de repressió, determinant que el domini d'unió al DNA, tot i que imprescindible, no és suficient per a que es doni la repressió, ja que la correcta disposició nuclear i per tant, també l'activitat de GAGA, depenen en part de la regió X. Posteriorment, vàrem passar a validar els resultats en un sistema de mosques transgèniques, concloent que la repressió de Trl per GAGA es dóna igualment, de forma independent de teixit i d'estadi de desenvolupament. A més, emprant RT-PCR quantitativa hem demostrat que, tant a mosca com a cèl·lules, la sobreexpressió de GAGA es tradueix en una davallada dels mRNAs transcrits a partir de la còpia endògena de Trl, indicant que la repressió és molt probablement a nivell transcripcional.Finalment, hem realitzat un experiment de transcriptòmica global en funció de la sobreexpressió i depleció de GAGA via RNAi. Els resultats obtinguts indiquen clarament que GAGA és un activador en tots els casos excepte, potser, en uns pocs promotors en els que està per veure si ho fa directa o indirectament. A més, qualsevol sobreexpressió de GAGA és extraordinàriament letal per a la mosca, fet que justifica la rellevància de l'autoregulació de Trl in vivo. A més, hem vist que la sobreexpressió de la isoforma GAGA519 comporta una major letalitat que la de GAGA581, indicant un possible camí funcional diferent per a les dues isoformes.