Efecte del diàmetre fol·licular sobre el desenvolupament i la qualitat dels embrions caprins produïts in vitro
- Autores: Roser Romaguera Matas
- Directores de la Tesis: Maria Dolors Izquierdo i Tugas (dir. tes.), María Teresa Paramio Nieto (dir. tes.)
- Lectura: En la Universitat Autònoma de Barcelona ( España ) en 2010
- Idioma: catalán
- Tribunal Calificador de la Tesis: Francesca Vidal Domínguez (presid.), José Folch Pera (secret.), Dimitrios Rizos (voc.)
- Materias:
- Enlaces
- Resumen
El principal objectiu d'aquesta tesis ha estat determinar si el diàmetre fol·licular és un bon paràmetre no invasiu per tal d'avaluar la qualitat de l'oòcit en funció de la seva competència per al desenvolupament embrionari i la qualitat del blastòcit resultant en la cabra prepúber. A més, s'ha proposat una nova estratègia per tal d'incrementar el desenvolupament embrionari d'aquells oòcits compromesos degut al petit diàmetre (<3 mm) del seu fol·licle d'origen. Per portar-ho a terme es van realitzar tres estudis. L'objectiu del primer estudi va ser avaluar alguns paràmetres ovocitaris (diàmetre ovocitari, apoptosi inicial i tardana), el desenvolupament embrionari i la qualitat del blastòcit (número mig de cèl·lules, ploïdia cromosòmica) dels oòcits de cabra prepúber de fol·licles petits (<3 mm), grans (≥3 mm) i d'un grup control (no seleccionats pel seu diàmetre fol·licular). Els oòcits de fol·licles ≥3 mm de diàmetre es van obtenir per la tècnica d'aspiració amb una agulla 21G i una xeringa d'insulina, els oòcits de fol·licles <3 mm van ser recuperats per la tècnica de slicing d'ovaris que prèviament havien estat aspirats i els oòcits control van ser recuperats per slicing però d'ovaris que prèviament no havien estat aspirats. Abans de la maduració in vitro, un grup d'oòcits eren mesurats i processats per a la tinció d'Annexin-V o l'assaig de TUNEL, mentre que la resta dels oòcits eren madurats, fecundats i cultivats in vitro durant 8 dies. Els blastòcits obtinguts van ser fixats i processats per a la Hibridació In Situ Fluorescent (FISH) amb sondes ovines de pintat específiques per els cromosomes X i Y. Els oòcits de fol·licles ≥3 mm van presentar un major diàmetre ovocitari mig (128.27 ± 7.20 μm vs. 125.35 ± 7.59 μm; P<0.05), major percentatge d'oòcits TUNEL positiu (42.86% vs. 24.23%; P<0.05), major percentatge de dividits (47.85 ± 3.98% vs. 23.07 ± 2.44 %; P<0.05) i de blastòcits (19.77 ± 3.04% vs. 4.11 ± 1.10 %; P<0.05) que els oòcits de fol·licles <3 mm. No obstant, els blastòcits de fol·licles ≥3 mm i <3 mm no van presentar diferències en el número mig de cèl·lules (123.83 ± 49.62 vs. 104.29 ± 36.09, respectivament). A més, no es van trobar diferències significatives en el percentatge de blastòcits amb ploïdia anormal en els embrions produïts a partir d'oòcits de diferent diàmetre fol·licular. Tot i així, els blastòcits de fol·licles grans tenien un percentatge significativament menor de nuclis diploides i un major percentatge de nuclis tetraploides en comparació als blastòcits produïts a partir de fol·licles petits. En conclusió, es va observar una relació positiva entre el diàmetre fol·licular, el diàmetre ovocitari i el desenvolupament embrionari en cabres prepúbers. Per tant, el diàmetre fol·licular és un bon criteri de selecció pels oòcits de femelles prepúbers. És important destacar que tot i que els oòcits de fol·licles grans presentaven major percentatge d'apoptosi tardana (TUNEL positius) que els oòcits de fol·licles petits això no es va correlacionar amb un menor desenvolupament embrionari. Pràcticament tots els blastòcits produïts in vitro van ser mixoploides sense haver-hi diferències entre els diferents grups fol·liculars. L'elevat percentatge de blastòmers tetraploides observats en els oòcits que procedien de fol·licles grans podria conduir a un major desenvolupament d'aquests blastòcits. El segon estudi va sorgir com a conseqüència dels resultats obtinguts en el primer treball. La selecció dels oòcits de fol·licles grans ens va permetre obtenir un percentatge de blastòcits similar als descrits en cabres adultes (23-26%) (Crozet i col., 1995; Leoni i col., 2009). Per tant, això podria indicar que el factor determinant en la competència ovocitària és el diàmetre fol·licular i no l'edat de la femella. El principal objectiu en aquest estudi va ser determinar en els oòcits de cabra prepúber i adulta, l'efecte de la grandària fol·licular (<3 mm i ≥ 3 mm) en la producció i la qualitat dels blastòcits. Els oòcits de cabres no estimulades hormonalment van ser recuperats in vivo per la tècnica de LOPU mentre que els de cabres prepúbers es van obtenir d'ovaris d'escorxador i de la mateixa manera que s'ha descrit en el primer estudi. Els oòcits van ser madurats i fecundats in vitro, i els embrions resultants van ser cultivats durant 8 dies addicionals. Tots els blastòcits amb una bona morfologia van ser vitrificats i després de la descongelació la seva re-expansió va ser avaluada. Finalment, aquells blastòcits que van sobreviure al procés de vitrificació/descongelació es va analitzar la seva ploïdia mitjançant la FISH amb una sonda ovina de pintat específic pels cromosomes X, Y i 20. El percentatge dels blastòcits obtinguts a partir del grup fol·licular de grandària <3 mm va ser major en cabres adultes que en prepúbers (28.17% vs. 5.45%, respectivament; P<0.05) no obstant, aquestes diferències no es van observar en fol·licles ≥3 mm (10.20% vs. 18.7%, respectivament; P>0.05). Pràcticament tots els blastòcits analitzats presentaven mixoploïdia (96.43%) no obstant, el percentatge de blastòmers diploides era significativament majors en blastòcits que provenien de fol·licles ≥3 mm en cabres adultes i prepúbers (84.73% and 80.82%) que en aquells blastòcits de fol·licles petits (62.18% and 73.63%). A més l'edat de la donadora no va afectar significativament la ploïdia embrionària i la re-expansió del blastòcit després de la descongelació quan la criosuperviviència era analitzada. Així doncs, l'edat de la donadora influencia el percentatge de blastòcits si els oòcits provenen de fol·licles <3 mm però no si aquests són recuperats de fol·licles majors a 3 mm. En relació a la qualitat dels blastòcits, el diàmetre fol·licular té efecte sobre la ploïdia dels nuclis dels blastòcits però no l'edat de la donadora. L'ovari de femelles prepúbers es troba quasi exclusivament constituït per fol·licles amb un diàmetre inferior a 3 mm (Martino i col., 1994). A més, en els dos estudis anteriors hem observat que els oòcits de fol·licles petits mostren una baixa competència per al desenvolupament. Així doncs, en aquest tercer estudi vam intentar dissenyar una nova estratègia per millorar el desenvolupament embrionari d'aquells oòcits compromesos pel diàmetre del seu fol·licle. En boví, s'ha observat que l'addició de "Oocyte Secreted Factors" (OSFs), BMP15 o GDF9 al medi MIV millorava el desenvolupament embrionari i la qualitat de l'embrió valorada per un increment del número de cèl·lules en el blastòcit i la supervivència fetal (Hussein i col., 2006). L'objectiu d'aquest estudi va ser investigar, en cabres prepúbers, l'efecte dels OSFs secretats pels oòcits denudats (ODs) de fol·licles petits (<3 mm) o grans (≥3 mm) durant la MIV sobre el desenvolupament embrionari i la qualitat del blastòcits dels complexes cumulus-oòcit (COCs) de fol·licles petits i determinar si el GDF9 participa en aquest procés. Els grups tractament eren: (A) els COCs no seleccionats pel seu diàmetre fol·licular (grup control); (B) els complexes cumulus-oòcit de fol·licles petits (SFCOCs), (C) els complexes cumulus-oòcit de fol·licles petits co-cultivat amb oòcits denudats de fol·licles petits (SFCOCs + SFDOs), i (D) els complexes cumulus-oòcit de fol·licles petits co¬cultivats amb oòcits denudats de fol·licles grans (SFCOCs + LFDOs). L'efecte d'addicionar l'inhibidor kinasa SB-431542, que antagonitza el GDF9, va ser testat en els tractament A, C i D. El co-cultiu de SFCOCs amb SFDOs o LFDOs va incrementar significativament el percentatge de blastòcits en comparació al grup no co-cultivat SFCOCs (15.77%, 17.39% vs. 10.31%, respectivament). Els blastòcits del grup SFCOCs + LFDOs van mostrar un major percentatge de nuclis tetraploides que els blastòcits del grup SFCOCs i el grup control (14.43% vs. 5.45% and 5.24%, respectivament; P<0.05) No obstant, no vam observar diferències en el percentatge d'eclosionats, el número mig de cèl·lules per blastòcit o la criotolerància embrionària (P>0.05) entre els quatre grups tractament. L'addició de SB-431542 durant la MIV no va tenir cap efecte en el percentatge de blastòcits (P>0.05). En conclusió, en cabres prepúbers, el baix desenvolupament embrionari dels complexes cumulus-òocit de fol·licles petits (<3 mm) pot ser millorat mitjançant el seu co-cultiu amb els oòcits denudats tan de fol·licles petits com grans i el GDF9 no sembla tenir cap paper en aquesta millora. Així doncs, l'addició d'alguns factors secretats pels oòcits al medi de maduració in vitro podria proporcionar-nos una nova eina per tal d'optimitzar els nostres protocols de producció in vitro d'embrions.
