Resumen de Chemically synthesized peptide libraries as a new source of BBB-shuttles. Use of Mass Spectrometry for peptide identification and quantification
Bernat Guixer Mañe
La barrera hematoencefálica (BH) es una barrera biológica situada en los capilares sanguíneos del cerebro que juega un papel crucial para la regulación del flujo de entrada y salida de moléculas necesarias para la correcta función de este órgano y para la protección enfrente agentes neurotóxicos. Esta estricta regulación dificulta el paso a través de la BH de los fármacos dirigidas al parénquima cerebral. Para superar este obstáculo, se han propuesto estrategias como el uso de lanzaderas de la BH. Estas se describen como moléculas tanto capaces de atravesar la BHE como capaces de asistir el paso de una molécula incapaz de cruzar la barrera enganchada a ella. Esta tesis se centra en el estudio y la puesta a punto de lanzaderas de la BH ya descritas para mejorar su eficacia, estabilidad y solubilidad y en la búsqueda de nuevos péptidos lanzadera por métodos de cribado de alto rendimiento. Se sintetizó una biblioteca de estereoisómeros basada en Ac-(N-MePhe)4-NH2, para evaluar el papel de la quiralidad en la difusión pasiva a través del ensayo de transporte in vitro PAMPA, compuesto por fosfolípidos cerebrales porcinos. Además, se diseñó y sintetizó una biblioteca de 21 análogos de Ac-HAIYPRH-NH2 para mejorar la eficacia, estabilidad y solubilidad de este péptido a través de un ensayo in vitro de BH basado en un co-cultivo celular. La técnica de cribado de alto rendimiento phage display se utilizó para explorar unidades peptídicas mínimas capaces de dirigir-se preferentemente al cerebro. Se sintetizó una biblioteca de fagos CX3C y se ensayó in vivo en ratones BALB/c. Los fagos CFLFC, CRWEC y CNSQC fueron seleccionados después de un protocolo de la panning compuesto de 3 rondas basadas en enriquecimiento al cerebro. Se realizaron experimentos de biodistribución y localización para ubicar el destino de los fagos seleccionados. Se ha desarrollado una nueva metodología de selección de alto rendimiento para buscar nuevos péptidos lanzadera de la BH, en el si de un espacio químico no disponible con la técnica phage display. Esta metodología combina la química combinatoria para la síntesis de bibliotecas de péptidos, los modelos in vitro que mimetizan la BH para la evaluación de las bibliotecas y técnicas avanzadas de espectrometría de masas para la identificación de los péptidos capaces de atravesar dichos ensayos in vitro. Se sintetizó una biblioteca de péptidos compuesta por D-Ala, D-Arg, D-Ile, D-Glu, D-Ser, D-Trp y D-Pro con el método mix & split. Con la metodología desarrollada se encontraron secuencias prometedoras comprendidas dentro de las composiciones peptídicas I3-A1-P1-R1, I4-P1-R1, I3-P2-R1, P3-S2-R1 and A3-R2-P1 después de ensayar in vitro la biblioteca.
